[发明专利]用于以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的引物、试剂盒、检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的引物、试剂盒、检测方法及试剂盒检验方法，属于生物技术领域。

背景技术

禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。禽甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜；其基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。禽甲型流感病毒除感染禽外，还可感染猪、马、水貂和海洋哺乳动物。自1959年以来，H5、H7和H9等亚型病毒已逾10次跨越物种障碍感染人类。现在已经确认能够感染人的禽流感病毒共有8种，包括H5N1、H5N2、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、H10N7，以及2013年发现的H7N9。

自2013年2月起，中国爆发了人感染H7N9禽流感病毒的疫情，临床表现为流感样症状和重症肺炎，病死率高，导致至少131人发病，其中39人死亡（截止2013年5月31日）。这种全球首次发现的新型禽源性重组甲型流感病毒，在短期内造成了至少65亿美元的经济损失，并已对人类健康构成严重威胁，而且不能排除该病毒进一步进化成有效人传人，引发未来流感大流行的可能性。

加强对流感样病例尤其是重症肺炎，以及候鸟、家禽类的H7N9禽流感病毒的快速检测，对全球的H7N9疫情监测与防控意义重大。目前已有的免疫胶体金检测方法，敏感性较低，难以检出临床病例（Baas C,et al.Euro surveillance,2013）。基于H7N9禽流感病毒HA基因和NA基因的逆转录实时荧光定量PCR（rRT-PCR,世界卫生组织、中国疾控中心推荐方法，参见http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/influenza_h7n9/en/），具有敏感、特异的优点，但需昂贵的设备、专业的技术、繁琐的操作，不适合现场检测或者条件较差的基层实验室。因此，目前迫切需要建立一种新的简单易行、快速敏感的H7N9禽流感病毒检测方法。

据申请人所知，环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）及逆转录环介导等温扩增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP）是一类新型核酸扩增方法，扩增反应全过程均在同一温度下进行，不须像PCR反应那样需要经历几十个温度变化的循环过程，因此对扩增所需仪器的要求大大简化，整个扩增过程只需一台水浴锅或恒温金属浴即可，反应时间一般只需15min至60min，并且不需要通过繁琐的核酸电泳方法来检测结果，只需通过其副产物-白色的焦磷酸镁沉淀来观察结果（可用浊度仪实时扫描判定），或者预先加入HNB或钙黄绿素等金属离子螯合剂，通过反应前后的溶液颜色变化，直接目视观察以判断结果，无需其它任何设备。

其中，RT-LAMP方法具有简便、快速、敏感、高效的特点，非常适合在基层实验室甚至现场进行快速诊断，目前亟需建立一种能够灵敏、特异、高效检测H7N9禽流感病毒的RT-LAMP检测手段。

发明内容

本发明的第一目的是：针对现有技术存在的问题，提供一种用于以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的引物，可有效检测H7N9禽流感病毒。

本发明的第二目的是：提供含有上述引物的试剂盒，可用于检测H7N9禽流感病毒。

本发明的第三目的是：提供采用前述试剂盒的检测方法，可直观地根据反应液颜色判断结果，快速准确。

本发明的第四目的是：提供针对前述试剂盒的检验方法，确保使用正常的试剂盒来得到可靠的结果。

实现本发明第一目的的技术方案如下：一种用于以RT-LAMP法检测H7N9禽流感病毒的引物，其特征是，包括H7引物组和N9引物组；其中，

H7引物组包括外引物对H7-F3和H7-B3，内引物对H7-FIP和H7-BIP，以及环引物H7-LB；H7-F3的序列如SEQ ID NO:1所示，H7-B3的序列如SEQ ID NO:2所示，H7-FIP的序列如SEQ ID NO:3所示，H7-BIP的序列如SEQ ID NO:4所示，H7-LB的序列如SEQ ID NO:5所示；