[发明专利]禽肺炎病毒SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种禽肺炎病毒SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

禽肺炎病毒（avian pneumovirus，APV）是禽偏肺炎病毒属的成员，属于禽副黏病毒科，该病毒主要危害火鸡，但是近几年发现这种病毒也侵害不同品种的鸡，包括种鸡、商品肉鸡和鸡蛋，引起这些鸡发病。该病毒引起鸡发病的日龄一般在4-7周龄，在5-6周龄时最易发生。主要引起上呼吸道的症状，以喷嚏，眼结膜潮红，泪腺肿，明显的症状为头部出现皮下水肿，出现头部肿大；产蛋鸡感染该病毒主要引起产蛋下降，下降幅度在2%-40%之间，种蛋孵化率降低；随着病情的发展，会出神经症状；该病引起的发病率在1%-90%之间，引起鸡死亡率在1%-20%，如继发其它疾病的感染，引起的死亡会更大，对养禽业造成的危害极大。

禽肺炎病毒基因组为不分节段的负链RNA，长度约为14kb，根据其核苷酸和氨基酸序列可以将其经典的分为A、B、C、D等4个亚型，其中A亚型和B亚型呈世界范围内广泛流行，C亚型于1997年在美国科罗拉多分离，D亚型仅存在于法国。其基因组编码有8种蛋白，即N-P-M-F-M2-SH-G-L。其中F为融合蛋白，是该病毒主要抗原结构蛋白，具有吸附作用。

实时荧光定量PCR是一种融PCR和DNA探针杂交技术为一体的基因体外扩增技术，它通过实时检测PCR产物荧光信号的变化而达到检测病原核酸的目的，该技术具有操作简便、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，已成为动物病原检测的重要方法。SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR技术要比Taqman荧光定量RT-PCR技术简便，价格更低，但是检测的特异性要比Taqman荧光定量RT-PCR技术低。在建立SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR技术时，要消除引物二聚体的影响，即要进行溶解曲线分析，为单一的峰时特异性才好。同样，该技术还可以根据建立的标准曲线，直接从检测到的荧光阈值推算样品中相应病原的含量，在临床检测和对疾病进程的评价上具有很高的实用价值。

目前，还没有应用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR技术检测鉴别禽肺炎病毒的研究报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测禽肺炎病毒的引物对。

本发明所提供的用于检测禽肺炎病毒的引物对，由引物1和引物2组成，所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA，所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA。

其中，序列1由20个核苷酸组成；序列2由20个核苷酸组成。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测禽肺炎病毒的试剂。

本发明所提供的用于检测禽肺炎病毒的试剂，由所述引物对、SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR扩增缓冲液和水组成。

所述SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR扩增缓冲液，包括dNTPs、Mg²⁺、SYBRGreen I、DNA聚合酶、反转录酶和RNA酶抑制剂。

在本发明的一个实施例中，所述SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR扩增缓冲液（记为缓冲液A）中，所述dNTPs、所述Mg²⁺、所述DNA聚合酶、所述反转录酶和所述RNA酶抑制剂的配比为：0.1μmol：0.25μmol：5U：200U：40U。进一步，所述SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR扩增缓冲液，为来自于大连宝生物工程有限公司Takara产品：One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II（产品目录号：RR086A）。更加具体的，所述SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR扩增缓冲液，为将所述One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II（产品目录号：RR086A）中的2×One step SYBR RT-PCR buffer4（内含10mM dNTP Mixture，25mM Mg²⁺，SYBRGreen I等）和PrimeScript1Step Enzyne Mix2(内含Takara Ex Taq HS5U/μL、PremeScript RTase反转录酶200U/μL、RNA酶抑制剂40U/μL），按照体积比为10：1的比例混合后所得溶液。当然，使用其他公司的类似产品也可以。