[发明专利]基于克隆DNA混合池的全基因组测序方法

说明书

技术领域

本发明涉及全基因组测序技术领域，具体地指一种基于克隆DNA混合池的全基因组测序方法。

背景技术

全基因组序列作为一种研究物种全部遗传信息的重要资源受到越来越多的关注。从2001年人类基因组草图的完成，到2003年基因组全序列的正式完成以来，越来越多的物种完成了全基因组测序。对于植物基因组，拟南芥(Arabidopsis thaliana)作为一种重要的模式植物，是第一个完成全基因组测序的高等植物。水稻作为重要的粮食作物，其全基因组序列也已完成。其中，水稻籼稻品种(Oryza sativa ssp. indica)和粳稻品种(Oryza sativa ssp. japonica)的全基因组序列均完成于2005年。另外，重要的饲料作物玉米的全基因组序列于2009年完成。

目前，全基因组测序的策略主要有两种：clone-by-clone(CBC)和全基因组鸟枪法。

CBC的策略是首先构建遗传图谱(Genetic map)和物理图谱(Physical map)，再根据物理图谱选择最小重叠路径(Minimal tiling path, MTP)上的克隆(BAC或YAC克隆)进行测序。对克隆序列组装后，再将克隆序列一步一步地回归定位到物理图谱、遗传图谱和染色体上。在整个全基因组序列构建过程中，构建物理图谱是非常耗时费力的一步。基于文库的构建物理图的常用方法大致可以分为两类，基于标记的方法和限制性酶切图谱的方法。基于标记的方法一般是将克隆混合成多维的混合池(Pool)，然后用特定的探针与混合池进行杂交或用设计好的引物对混合池进行PCR扫描，从而确定每个混合池含有的标记，再通过计算筛选得到每个克隆可能含有的标记。利用限制性酶切图谱的方法，一般是用一种或多种限制性酶将每个克隆进行完全消化，然后对消化后的DNA片段进行电泳分离，从而得到每个克隆消化后DNA片段的长度信息，再根据这些片段长度信息利用计算机软件把相互重叠的克隆连接起来，形成重叠群(Contig)。与基于标记的方法相比，限制性酶切图谱的方法具有更高的分辨率和准确性，是现在用来构建物理图谱应用较多方法。特别是利用荧光标记分辨DNA片段，并利用基因分析仪进行高通量自动化分析方法的开发，使得限制性酶切图谱的方法得到更广泛的应用。

物理图谱对于定位基因，确定染色体，构建框架和全基因组的序列组装是一种非常重要的工具，也是一种非常有用的基因组资源。同时，对于研究基因的功能和物种进化有着很大的价值。利用CBC策略完成全基因组测序的代表物种主要有人类，拟南芥，水稻的粳稻品种，玉米等。这些基因组的全序列的质量非常高，常作为很多研究中的参考序列。基于CBC策略进行全基因组测序，因为其高分辨率和高准确性，使其已经成为一种全基因组测序的“黄金法则”。但是，它也有不可避免的缺点：构建物理图谱需要耗费大量的人力物力和时间，是整个测序过程中最为复杂的一步。因此，这种全基因组测序策略的应用也受到一定限制。

另一种全基因组测序的策略是全基因组鸟枪法测序(Whole genome shotgun sequencing, WGS)。这种方法不需要构建物理图谱，直接将要测序物种的全基因组随机打断成一定长度范围的小片段，将这些小片断插入到载体中，再对这些小片段文库直接进行测序，如人类的全基因组测序时，除了CBC方法外，也用了全基因组鸟枪法；水稻的籼稻品种93-11的全基因组序列便是用这种方法完成的。然后，将得到的序列根据序列的重叠信息进行拼装，得到序列重叠群。再将这些拼装后的序列定位到染色体上。在对小片段文库进行测序时，又有两种策略，一种是进行单向测序即只测得插入片段一端的序列；另一种是进行双末端测序(Paired-end sequencing)，其两端的序列方向相反。相比于单向测序，双末端测序不仅能够利用序列之间的重叠信息来组装序列重叠群，也可以利用插入片段的长度信息来将序列重叠群连接成更长的Scaffold。尽管双末端测序能够将序列重叠群相连接，但是由于重复序列或大的缺口的存在，还有很多的序列无法连接起来。针对这个问题，常常会构建多个不同插入片段大小的测序文库如人类基因组测序时就构建了2-kb，10-kb和50-kb的测序文库，这样能够有效地提高序列拼装的连续性。由于全基因组鸟枪法测序有着简单快速并不需要构建物理图谱的优点，特别随着下一代测序技术(Next-generation sequencing technologies, NGS)的不断发展，这种方法的运用越来越广泛。