[发明专利]一种重组大肠杆菌及制备磷脂酶C的方法和脱胶工业中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种磷脂酶C基因工程菌的构建方法及其应用，属于基因工程和酶工程领域。 

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种腐生性厌氧梭状芽孢杆菌，可产生强烈的外毒素引起创伤性气性坏疽、人类食物中毒以及动物坏死性肠炎、肠毒血症等病症。产生的外毒素种类很多，有α、β、Y、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν12种，其中α毒素(C．perfringens alpha toxin，CPA，又称磷脂酶C)产生于各毒素型产气荚膜梭菌，是第一个被发现既具有酶活性又具有毒素特性的细菌蛋白，被认为是最基本、最重要的毒力因子。α毒素是由370个氨基酸组成的单链多肽，分子量约43kD，它是一种依赖于Zn²⁺的多功能性金属酶，由2个功能区组成，N端具有磷脂酶C活性，C端具有鞘磷脂酶活性，能同时水解组成细胞膜的主要成分磷脂酰胆碱和鞘磷脂，破坏细胞膜的完整性，导致细胞裂解，从而具有细胞毒性、溶血性、致死性和皮肤坏死性等特性，在产气荚膜梭菌的致病过程中起着至关重要的作用。 

毛油中的胶质主要成分为磷脂，磷脂易与多种金属离子形成配位化合物和盐类，造成成品油的酸败和回色；磷脂遇高温易生成大量黑色沉淀，造成过滤困难，加重脱色工序负担，严重时还会造成设备结焦；磷脂会在脱酸等工序中形成乳化，增加炼耗和用碱量。因此磷脂的存在大大影响油脂的质量和精炼的经济效益。传统的脱胶工艺，如水化脱胶，酸法脱胶等能脱除绝大部分磷脂，但效率一般不超过90%，而且会消耗大量的水，在环保、质量、经济等方面都存着缺陷，因此应用新型磷脂酶进行油脂中磷脂脱除的酶法脱胶技术得到越来越多人的关注。磷脂酶A是目前较常用的酶法脱胶用酶之一，主要包括磷脂酶A1（PLA1）和磷脂酶A2（PLA2），可以特异水解磷脂甘油Sn-1位或Sn-2位上的酯键，生成亲水性较好的溶血磷脂（LPA）和游离脂肪酸（FFA），从而去除非水合磷脂，具有适用性广，反应条件温和，生产中节省酸碱化学品的消耗，几乎不产生皂脚和废水等优点。磷脂酶C(PLC)主要作用于甘油磷脂C3位上甘油磷酸酯键，水解产物为甘油二酯（DAG）及磷脂酸化合物（磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸以及磷酸肌醇等），因DAG可与甘油三酯（TAG）共同 成为油的一个成分不需被除去，而引起油脂行业的关注。PLC也具有一般酶法脱胶的共同优点，但相较于其他的酶法脱胶，如磷脂酶A（PLA）酶法脱胶，PLC酶法脱胶不仅能大大缩短脱胶时间，还能够有效提高毛油得率，降低毛油损耗，通常每500ppm磷就可以提高约1%的油产量，给油脂企业带来巨大的利润，因此被越来越多的作为一种新兴的酶法脱胶用磷脂酶在油脂脱胶工艺中使用，研制出具有我国自主产权，低价、优质、通用性强的酶法脱胶用PLC具有非常重要的现实意义。 

发明内容

鉴于上述和/或现有酶基因工程和酶工程领域中存在的问题，提出了本发明。 

因此，本发明其中一个目的是提供一种重组大肠杆菌。 

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一株重组大肠杆菌BL21（DE3）-pET28a-C.p-PLC，保藏编号为CCTCC No.M2013302。 

作为本发明所述重组大肠杆菌BL21（DE3）-pET28a-C.p-PLC CCTCC No.M2013302的一种构建方案，其中：由下述方法制得： 

（1）以保藏编号为CICC No.22949的产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的基因组为模板，克隆得到磷脂酶C基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示； 

（2）将步骤（1）所得磷脂酶C基因克隆到表达载体pET-28a（+）上，得到重组载体； 

（3）将步骤（2）所得重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，构建得到重组大肠杆菌。 

本发明所提供的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)-pET28a-C.p-PLC，已于2013年6月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：No.M2013302，地址：中国，武汉，武汉大学。该菌株以下简称：大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)-pET28a-C.p-PLC。 

本发明的另一个目的是提供一种利用重组大肠杆菌BL21（DE3）-pET28a-C.p-PLC作为发酵菌株进行液体发酵来制备磷脂酶C的方法，该制酶方法生产工艺简单、成本低、易于工艺放大，，在植物毛油脱胶方面具有一定 的应用前景。