[发明专利]用于鉴定条斑紫菜耐高温品系TM-18的方法、分子标记及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术及应用领域，涉及一种条斑紫菜耐高温品系TM-18的分子标记及其构建方法。

背景技术

条斑紫菜是我国长江以北紫菜的主要栽培品种，在经济海藻产业中占有重要地位，行业总产值约30亿元左右。

条斑紫菜是冷温性海藻，处于育苗阶段的紫菜丝状体耐高温，能自然度过夏秋高温期，适宜的生长温度为20-25℃；丝状体在秋初成熟，释放出壳孢子，壳孢子萌发成长为叶状体，叶状体在秋末、冬、春初的低温下生长，100个细胞以内的幼藻体生长适温为18-20℃，并有一定的温度耐受力，而大的藻体对温度的耐受力差，温度上升会导致提前衰老，且易发生病烂。近年来，壳孢子采苗期间及采苗后1个月左右的海水温度回升现象连续多次发生，严重干扰了条斑紫菜的正常生长和发育，导致烂苗和掉苗，使紫菜产量大幅下降，造成巨大的经济损失。因此，条斑紫菜耐高温品系的选育工作十分紧迫，已经引起了研究者的广泛重视。

近年来，条斑紫菜新品系的选育已经取得了一定进展，并开始了小规模的生产性试验。王华芝等（王华芝,严兴洪,李琳.条斑紫菜耐高温品系的筛选及特性分析.海洋与湖沼,2012,43(2):363-369.）报道了条斑紫菜耐高温品系TM-18的选育及生物学特性。

但受到海区环境等因素的影响，传统的形态学方法难以鉴别耐高温品系与其他品系，限制了良种的推广和应用。随着分子生物学的发展，分子标记技术日趋成熟，可以从DNA分子水平检测条斑紫菜品系间的变异，目前已经有广泛的应用。

发明内容：

本发明目的在于提供一种用于鉴定条斑紫菜耐高温品系TM-18的方法。

本发明还提供了用于鉴定条斑紫菜耐高温品系TM-18的分子标记、PCR扩增特异性引物及其构建方法，可以快速、准确的对该条斑紫菜耐高温品系进行鉴别，为条斑紫菜选育、良种认证提供依据。

本发明应用SRAP标记技术，对条斑紫菜品系进行分析，获得条斑紫菜耐高温品系TM-18的特异性条带，经过回收测序，得到了特异性条带的序列信息，并根据序列设计引物，将特异性条带转化为SCAR标记。本发明的分子标记可以用于快速准确的鉴定条斑紫菜耐高温品系TM-18，可以作为良种认证和知识产权保护的分子标记。

技术方案为，一种用于鉴定条斑紫菜耐高温品系TM-18的分子标记，含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。优选的，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

一种用于鉴定条斑紫菜耐高温品系TM-18的分子标记的特异性扩增引物，正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2和No.3所示：

正向引物：5’—TATCTTTGTATTGGGTTTGC—3’；

反向引物：5’—TTCCAGTAGGCGGTATCA—3’

上述特异性扩增引物可应用于鉴定条斑紫菜耐高温品系TM-18。

上述引物可用于鉴定条斑紫菜耐高温品系TM-18，方法包括以下步骤：

（1）总DNA的提取：收集新鲜的待鉴定条斑紫菜叶状体，液氮研磨，提取总DNA；

（2）使用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的特异性扩增引物，对步骤（1）中所获得的总DNA进行PCR扩增；

（3）取步骤（2）的PCR扩增产物进行电泳检测，若PCR扩增产物中出现长度为341bp的特异性片段，则所鉴定的条斑紫菜为条斑紫菜耐高温品系TM-18；若没有出现341bp的特异性片段，则所鉴定的条斑紫菜不是条斑紫菜耐高温品系TM-18。

步骤（2）所述PCR扩增的条件为：93～95℃预变性4.5～6min；93～94.5℃变性27～35s，51～52.5℃退火40～50s，71～73℃延伸40～50s，以上三个步骤重复32～40个循环；71～73℃延伸6～8min。

优选的，PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸45s，以上三个步骤重复35个循环；72℃延伸7min。

经测序，条斑紫菜耐高温品系TM-18中所获得的长度341bp的特异性片段，核苷酸序列为SEQ ID No.1中的第415至545的片段。

用于鉴定条斑紫菜耐高温品系TM-18的分子标记的构建方法包括以下步骤：

（1）总DNA的提取：收集各条斑紫菜选育品系的新鲜叶状体，经液氮研磨，使用DNA提取试剂盒，分别提取各品系的总DNA。