[发明专利]光子晶体微球液相芯片化学发光法高灵敏度多重检测真菌毒素的方法

说明书

技术领域

本发明设计农产品、饲料和食品中的真菌毒素快速、高通量、低成本检测技术方法。具体通过谷物中典型的黄曲霉毒素（AFB1）、伏马毒素（FB1）和赭曲霉毒素（OTA）为检测对象，利用三维光子晶体微球液相芯片为载体，通过竞争免疫方法在光子晶体微球表面构建液相芯片化学发光高灵敏度，高通量检测新技术。 

背景技术

真菌毒素是由污染农产品的某些真菌在一定的外部环境下所产生的次级代谢产物，真菌毒素往往会通过食物链进入人体，对人体造成不同程度的影响。在已知的真菌毒素中，黄曲霉毒素、伏马毒素和赭曲霉毒素等对人体危害较为严重。基于此，世界各国和地区都制定了严格的标准，以保护本国的农产品、食品和饲料等的安全。人们长期以来努力采取各种措施，研发新的检测方法来防止真菌毒素进入人类食物链中。目前常用的检测方法有色谱法、免疫分析法等。色谱法主要包括薄层色谱法、气相色谱法及液相色谱法。免疫分析法包括免疫亲和柱层析法、酶联免疫吸附法等。这些常用的检测方法长期以来对真菌毒素的检测起着非常重要的作用。但是随着经济的发展，人们生活水平的提高，食品安全意识的不断增强以及新型的有害物质的发现；同时许多国家为了保护本国国民健康或者制造技术性贸易壁垒，都规定了农产品、食品和饲料中真菌毒素的含量标准。这些都要求检测方法能够快速有效的同时检测多种真菌毒素。并且随着各国经济交流的日益增强，传统的检测方法已经逐渐显现出不足，如检测成本高，试剂用量大，检测仪器昂贵，检测时间长等缺点。基于此，研究和开发一种新型的检测成本低，检测时间短，试剂用量少，灵敏度高，能够同时检测多种真菌毒素的检测技术和方法具有重要的现实意义。 

发明内容

本发明目的在于开发一种高灵敏度、高通量、低成本、检测时间快、特异性好的检测食品中真菌毒素新技术，以替代传统色谱技术或酶联免疫法（ELISA）真菌毒素检测的方法。 

本发明的原理如图1所示，在同一体系中，分别在粒径大小相同，反射峰位置不同的光子晶体微球表面用双氧水：浓硫酸（3：7）溶液进行羟基化修饰，用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）环氧基修饰，固定真菌毒素包被抗原，牛血清蛋白（BSA）封闭。包被的抗原与真菌毒素标准品或试样中真菌毒素竞争结合真菌毒素抗体，用标记有辣根过氧化物酶的二抗与真菌毒素抗体特异性结合，用微球的反射光谱或其结构色识别不同的真菌毒素探针。添加化学发光底物后，用多功能酶标仪检测化学发光信号值强弱。建立标准曲线和同时检测 食品中的多种真菌毒素。 

本发明所属用光子晶体微球流式芯片检测真菌毒素的方法，是采用光子晶体微球为真菌毒素探针载体，在微球表面进行竞争免疫检测真菌毒素，以黄曲霉毒素（AFB1）、伏马毒素（FB1）和赭曲霉毒素（OTA）为检测对象，通过真菌毒素与微球表面固定抗原竞争各自的抗体，利用标记有辣根过氧化物酶的二抗与抗体特异性结合，利用各光子晶体的反射光谱进行解码，加入化学发光底物，利用多功能酶标仪检测化学发光信号强度。 

上述方法包括以下步骤： 

（1）光子晶体微球的制备 

（2）光子晶体微球表面的修饰：通过体积比3：7的双氧水与浓硫酸对步骤（1）得到的微球表面进行羟基化修饰，再用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）对微球表面进行环氧基修饰； 

（3）抗原的固定：通过化学键合的方法将黄曲霉毒素（AFB1）、伏马毒素（FB1）和赭曲霉毒素（OTA）人工抗原AFB1-BSA,FB1-BSA,OTA-BSA固定于经步骤（2）表面修饰的微球表面。 

（4）用光子晶体微球流式芯片对待测样品进行竞争免疫检测，利用标记有辣根过氧化物酶的二抗与各自真菌毒素抗体进行特异性反应，利用光纤光谱仪对各微球进行解码，加入化学发光底物后，用多功能酶标仪对发光信号强度进行同时检测。 

光子晶体微球的制备：将装有单分散纳米二氧化硅乳液的1号注射器及装有甲基硅油的2号注射器连接到三通管上，利用微流注射泵将甲基硅油和单分散纳米二氧化硅乳液通过三通管混合包裹，并通过玻璃管流入疏水性的收集器皿中，在界面力的作用下单分散纳米二氧化硅乳液形成球状结构。 

以不同纳米二氧化硅颗粒自组装技术制备上述的粒径相同的光子晶体为球，各微球具有不同的反射光谱。