[发明专利]一种快速检测麻疹病毒/风疹病毒的核酸检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸检测试剂盒，具体涉及一种快速检测麻疹病毒/风疹病毒的核酸检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性呼吸道传染病。主要通过飞沫传播，临床症状有发热、咳嗽、流涕、眼结膜充血、口腔粘膜有红晕的灰白小点。单纯麻疹预后良好，重症患者病死率较高。感染者是唯一的传染源，自发病前2天(潜伏期末)至出疹后5天内，眼结膜分泌物、鼻、口咽、气管的分泌物中都含有病毒，具有传染性。麻疹病毒是麻疹的病原体，分类上属于副粘病毒科麻疹病毒属，麻疹病毒只有一个血清型，人是麻疹病毒的自然界中唯一的宿主。风疹是由风疹病毒引起的一种急性呼吸道传染病。主要通过呼吸道和直接接触传播。其临床特征为上呼吸道轻度炎症、发热、全身红色斑丘疹、耳后、枕后及颈部淋巴结肿大，病情较轻，预后良好。孕妇在怀孕早期感染风疹，易导致胎儿发生先天性风疹综合症。风疹病毒为RNA病毒，属于披盖病毒属。风疹病毒抗原结构稳定，只有一种抗原型，只感染人类。

风疹与轻型麻疹症状相似，与人类小DNA病毒B19、猩红热、幼儿急疹和肠道病毒引起的出疹容易混淆。所以实验室鉴别诊断的地位愈来愈重要。常用的风疹、麻疹的实验室检测方法主要有病毒分离培养、血清学检测以及核酸检测等方法。由于Elisa法检测灵敏度低，假阳性高；病毒分离培养费时费力，不利于快速检测，且病毒培养具备一定的危险性。近年来运用荧光PCR技术检测的病毒种类越来越多。对于荧光PCR检测病毒来说，引物的设计至关重要，其直接影响检测的特异性。如果引物的特异性不够，则可能导致假阳性的出现。我们针对病毒特异的靶序列设计Taqman探针，用于检测病毒时很大程度上保证了结果的特异性。

目前国内的核酸诊断中应用最为广泛的是以荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术。检测探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5′→3′外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。在每次PCR循环中，都有新的报告基团被剪切，因此荧光信号强度的增加与扩增产物的数量成正比。

双重荧光定量PCR技术则是在同一反应体系中加入两条不同荧光标记的探针。例如，针对靶基因1的探针标记FAM，针对靶基因2的探针标记HEX。PCR反应过程中，若待检样本包含靶基因1，则标记FAM的探针产生荧光信号；若待检样本包含靶基因2，则标记HEX的探针产生荧光信号。这样，同一管反应则可确定两个靶基因(如图1所示)。

现有的麻疹病毒/风疹病毒检测试剂盒大多存在特异性差、灵敏性较低等缺陷，有待改进。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是克服现有的麻疹病毒/风疹病毒检测试剂盒特异性差、灵敏性较低等缺陷，提供一种快速检测麻疹病毒/风疹病毒的核酸检测试剂盒，该试剂盒具有高通量、操作简便、重复性强、检测结果快速客观等优点，对麻疹病毒/风疹病毒的检测具有良好的应用前景。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种快速检测麻疹病毒/风疹病毒的核酸检测试剂盒，包括以下各组分：RT-PCR反应液、酶混合液、麻疹病毒/风疹病毒反应液、阳性对照和阴性对照。

其中，所述的麻疹病毒/风疹病毒反应液包括以下2组组分：

组分(1)：由一对检测麻疹病毒的引物和一条检测麻疹病毒的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；

组分(2)：由一对检测风疹病毒的引物和一条检测风疹病毒的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.6所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。

其中，所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED640等荧光报告基团，且组分(1)和组分(2)中的荧光报告基团不同；所述的荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra等任意两种荧光淬灭基团。

本发明对上述引物和探针的配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，它们之间不同的配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异，本发明通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果：