[发明专利]一种褐藻多糖硫酸酯的质量分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物检测领域，具体涉及一种褐藻多糖硫酸酯的的质量分析方法。

背景技术

褐藻多糖硫酸酯是一类硫酸化多糖，存在于部分海洋褐藻和海洋无脊椎动物中，首先由Kylin在1913年用稀酸从掌状海带中提取出来。Kylin将提取物水解后分离出L-岩藻糖，他将这种多糖命名为fucoidin，现根据多糖的命名原则一般定名为fucoidan，中文名称为褐藻多糖硫酸酯，也被称为岩藻多糖、岩藻聚糖、岩藻聚糖硫酸酯或褐藻糖胶。现在人们对褐藻多糖硫酸酯的组成有较为清晰的了解，它是一类化学组成和结构非常复杂的多糖，以岩藻糖和硫酸基为主，随着褐藻的种类不同还含有少量半乳糖、木糖、糖醛酸等其他成分。

褐藻多糖硫酸酯是具有多种生物活性的一类类肝素多糖，现已报道褐藻多糖硫酸酯具有抗凝血、提高免疫力、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、以及用于治疗慢性肾衰、糖尿病肾病、心肌缺血和帕金森病等多种疾病。

含量测定是药物可靠性的重要依据。目前测定褐藻多糖硫酸酯含量的主要方法有半胱氨酸硫酸法、Cameron 法、气相色谱法和液相色谱法。这些方法都需要将待分析的褐藻多糖硫酸酯样品先水解, 再分离或衍生化, 间接测定褐藻多糖硫酸酯中岩藻糖的含量, 因操作繁琐, 对定量分析不方便。而且由于不同褐藻多糖硫酸酯中岩藻糖含量有所不同，依据岩藻糖来确定褐藻多糖硫酸酯的含量难免会有所偏差。

同时，药物开发必须对药物的体内代谢产物和代谢机理进行研究，确保药物在体内的活性和安全性，也能够指导新药设计、优选给药方案、改善药物剂型等。褐藻多糖硫酸酯经体内代谢后，血清、器官等生物组织中药物浓度低，在分析前还要去除蛋白质、类脂等其他影响结果测定的杂质，这必然造成褐藻多糖硫酸酯药物一定程度的损失，使分析样品中药物浓度更低。所以要进行这些样品的微量检测，难度很大，致使褐藻多糖硫酸酯的药代动力学研究一直进展缓慢。之前采用的半胱氨酸硫酸法、Cameron法由于检测限度高，不能用于微量分析。

气相色谱法和液相色谱法需将褐藻多糖硫酸酯水解为岩藻糖，再进行色谱分析。由于岩藻糖在强酸条件下不稳定，导致水解后的岩藻糖测定结果重现性差、误差较大，难以对生物样品中微量褐藻多糖硫酸酯进行准确分析。这就要求建立一种高灵敏度、重现性好的微量分析方法，检测体内样品的褐藻多糖，为药代动力学研究提供条件。

发明内容

本发明的目的是提供一种高灵敏度、重现性好、稳定性佳的褐藻多糖硫酸酯质量分析方法。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是，一种褐藻多糖硫酸酯的质量分析方法，所述质量分析方法利用HPLC-柱后衍生-荧光检测法对褐藻多糖硫酸酯进行含量分析，其色谱条件为：色谱柱采用至少一根以上适合多糖的分离范围为2,000 – 1,000,000 道尔顿的色谱柱组成；流动相采用50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 6.7）-乙腈（87:17，V/V）；HPLC柱温为室温；流速为 0.1 mL/min – 1.0 mL/min；

柱后衍生条件：衍生试剂：50 - 500 mmol/L盐酸胍；反应液：0.1 - 2.0 mol/L氢氧化钠；衍生液流速：0.2-0.5 mL/min；冷却液：0.5 mol/L氢氧化钠；冷却液流速：0.1 - 0.5 mL/min；柱后反应器温度：70-130 ℃；

荧光检测条件：激发波长Ex=255 nm；检测器发射波长Em=430 nm；

检测方法采用外标法，以高纯度褐藻多糖硫酸酯作为标准。

其中，所述质量分析方法还有生物样品前处理步骤：将血清或组织匀浆液中加入 0.1-1.0 mol/L 氯化钠；根据褐藻多糖硫酸酯分子量大小，采用截留分子量大于褐藻多糖硫酸酯分子量范围的膜进行超滤离心。

优选的，色谱条件为：色谱柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ（300 mm×7.6 mm）；柱温箱温度：室温；流动相：50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 6.7）—乙腈（87:17，V/V）；高效液相系统的流速：0.5 mL/min；进样体积：20 μL。

柱后衍生条件：

反应系统条件：衍生反应液浓度：0.5 mol/L氢氧化钠和200 mmol/L盐酸胍，衍生液流速：0.3 mL/min；冷却液：0.5 mol/L氢氧化钠，冷却液流速：0.3 mL/min；柱后反应器温度：125℃。

荧光检测条件：检测器激发波长Ex=255 nm；检测器发射波长Em=430 nm；PMT=14或17。