[发明专利]新颖的天冬酰胺酶变体及其用途

说明书

本发明是申请日为2008年4月17日、申请号为200880012810.1、题为“新颖的天冬酰胺酶变体及其用途”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及新鉴定出来的天冬酰胺酶多肽变体和包含编码这些天冬酰胺酶变体的基因的多核苷酸序列。本发明涉及鉴定合适的天冬酰胺酶变体的方法。本发明还涉及在工业工艺中使用这些变体蛋白的方法。本发明还包括经根据本发明的多核苷酸转化过的、适于生产这些蛋白的细胞以及其中已根据本发明对蛋白进行了遗传修饰以增强或降低其表达水平和/或活性的细胞。本发明还涉及在工业工艺中使用这些蛋白的方法。

发明背景

近来，公开了丙烯酰胺在很多经加热食物产品中的出现(Tareke et al.Chem.Res.Toxicol.13，517-522(2000))。鉴于丙烯酰胺被认为可能对动物和人致癌，该发现导致产生了世界范围的关注。进一步的研究揭示，在多种经烘焙、煎炸和烤箱制备的常见食物中可检测到相当含量的丙烯酰胺，并且显示，食物中丙烯酰胺的出现是加热工艺的结果。

Mottram et al.Nature419：448(2002)已提出了作为Maillard反应的结果从氨基酸和还原糖形成丙烯酰胺的途径。根据该假说，丙烯酰胺可在Maillard反应期间形成。在烘焙和烘烤(roasting)期间，Maillard反应负责颜色、气味和味道。与Maillard相关的反应是氨基酸的Strecker降解，提出了形成丙烯酰胺的途径。当温度超过120℃，可检测到丙烯酰胺的形成，在170℃左右观察到了最高的形成速率。当存在天冬酰胺和葡萄糖时，可观察到最高的丙烯酰胺水平，而芥氨酰胺和天冬氨酸仅导致痕量。

EU中针对丙烯酰胺从食物接触的塑料迁移进食物的官方迁移限制被设置为10ppb(每kg10微克)。虽然对烹饪期间形成的丙烯酰胺尚没设置官方限制，但是很多产品(尤其是谷物类、面包产品和基于马铃薯或玉米的产品)超过该值这一事实导致了人们的关注。

已知若干植物原材料含有较高水平的天冬酰胺。在马铃薯中，天冬酰胺是占主要的游离氨基酸(940mg/kg，对应总氨基酸含量的40％)，在小麦面粉中，天冬酰胺以大约167mg/kg的水平存在，对应于总游离氨基酸的14％(Belitz and Grosch in Food Chemistry-Springer New York，1999)。丙烯酰胺主要从天冬酰胺(组合还原糖)形成，这一事实可解释经煎炸、烤箱烹饪或烘烤的植物产品中丙烯酰胺的高水平。因此，就公众健康方面的兴趣而言，急切需要具有低得多的丙烯酰胺水平，或者优选全无丙烯酰胺的食物产品。

已经提出了多种减少丙烯酰胺含量的解决方案，或者通过改变加工变量，例如，加热步骤的温度或持续时间，或者通过化学方式或酶促方式防止丙烯酰胺形成或者通过除去形成的丙烯酰胺来实现。

在若干专利申请中，已经公开了天冬酰胺酶用于减少天冬酰胺水平以及由此减少形成的丙烯酰胺的量的用途。已从若干种真菌来源产生了用于该目的的合适的天冬酰胺酶，例如，从Aspergillus niger(WO2004/030468中)和Aspergillus oryzae(WO04/032648中)。

虽然所有L-天冬酰胺酶都催化同样的化学转化，但这并不意味着它们适合用于同样的应用。多种不同的应用对酶被操作的必要条件提出了不同的要求。可能影响到酶促转化速率的物理和化学参数是温度(对化学反应速率有正面影响，但是可能对酶稳定性有负面影响)、水分含量、pH、盐浓度、食物基质的结构整合性、酶的活化剂或抑制剂的存在、底物和产物的浓度等。

因此，人们正需要改进的天冬酰胺酶，用于具有改进性质的多种应用。

发明目的

本发明的一个目的是提供新颖的天冬酰胺酶变体多肽和编码此类变体的多核苷酸。另一个目的是提供产生此类天冬酰胺酶变体的重组菌株。鉴定变体的方法、制造和使用根据本发明的多核苷酸和多肽的方法也是本发明的一部分。

发明内容