[发明专利]人类Y染色体SY84、SY134和SY255位点缺失的PCR检测液

说明书

技术领域

本发明涉及人类Y染色体缺失的PCR检测技术，具体涉及人类Y染色体SY84、SY134和SY255位点缺失的PCR检测液。

背景技术

育龄夫妇中约有10%～15%不育，其中病因在男性的占50%，除输精管道梗阻﹑感染等明确病因外，遗传性状改变也是其中一个重要的原因，主要是男方生精障碍，表现为严重少精（小于2×10⁶/mL～5×10⁶/mL）或无精子。临床不育的男性中大约有20%是由遗传性、非梗阻性的无精症或少精症引起的，这些患者大多染色体核型检测正常；但Y染色体微缺失导致遗传性不育。目前一般通过STSs进行PCR 来获取Y染色体微缺失信息，然而各文献报道的缺失率从1%～55%各不相同，所使用的STSs数量和位点可在1～131个STSs范围内变化，包括sY84（AZFa区）、sY134（AZFb区）、sY255（AZFc区）等STS位点。PCR检测这些STS位点时，操作中需要将水、镁离子、缓冲液（KCl和Tris-HCl等）、dNTP、引物、酶等分步骤逐渐加入到反应体系，操作过程繁琐，加入的各组分的配比比例不同，核酸的扩展效率不一，且存在反复冻融时扩增效率急剧下降等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种低温长期保存、耐受反复冻融，使用时只需加入DNA模板的人类Y染色体SY84、SY134和SY255位点缺失的PCR检测液。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：人类Y染色体SY84、SY134和SY255位点缺失的PCR检测液，包括镁离子（Mg²⁺）、dNTP、Taq酶、氯化钾（KCl）、三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）、SY84引物、SY134引物和SY255引物，该PCR检测液中镁离子的浓度为2.632mM，dNTP的浓度为0.263mM，Taq酶的浓度为105u/mL，氯化钾的浓度为50.63mM，pH值 8.3的三羟甲基氨基甲烷-盐酸的浓度为10.53mM，SY84引物的浓度为0.263μM，SY134引物的浓度为0.421μM，SY255引物的浓度为0.263μM。

与现有技术相比，本发明优点在于本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：人类Y染色体SY84、SY134和SY255位点缺失的PCR检测液，包括镁离子、dNTP、Taq酶、氯化钾、三羟甲基氨基甲烷-盐酸、SY84引物、SY134引物和SY255引物，该PCR检测液中镁离子的浓度为2.632mM，dNTP的浓度为0.263mM，Taq酶的浓度为105u/mL，氯化钾的浓度为50.63mM，pH值为8.3的三羟甲基氨基甲烷-盐酸的浓度为10.53mM，SY84引物的浓度为0.263μM，SY134引物的浓度为0.421μM，SY255引物的浓度为0.263μM；该PCR检测液可以在低温中长期保存，能耐受反复冻融，检测时只需加入DNA模板，操作简便，快速，扩增的特异性和灵敏性效果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

人类Y染色体SY84、SY134和SY255位点缺失的PCR检测液，该PCR检测液中Mg²⁺的浓度为2.632mM，dNTP的浓度为0.263mM，Taq酶的浓度为105u/mL，KCl的浓度为50.63mM，Tris-HCl （pH值为 8.3）的浓度为10.53mM，SY84引物的浓度为0.263μM，SY134引物的浓度为0.421μM，SY255引物的浓度为0.263μM。该PCR检测液可以在-20℃低温长期保存，使用时冻融也不影响检测效果，检测时只需加入DNA模板，操作简便，快速。Taq酶为自己制备,dNTP购于宝生物工程(大连)有限公司公司，SY84引物、SY134引物和SY255引物购于英潍捷基（上海）贸易有限公司。

实施例2

用柱洗脱法提取抗凝全血中的人DNA，作为模板DNA；检测时，在实施例1的PCR检测液中加入1uL DNA模板，在Eppendorf PCR仪中进行PCR扩增反应。PCR循环条件为:94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，57℃复性30sec，72℃延伸60sec，反应33个循环后，72℃再延伸10min；PCR产物于可以在4℃冰箱储存。取10uL PCR 产物，Gel red染色，经2%琼脂糖电泳，电泳电压5V/cm，电泳时间35min，反应产物条带位置及长度；若AZFa区域出现326bp条带，则SY84未缺失，若AZFb区域出现301bp条带，则SY134未缺失，若AZFc区域出现126bp条带，则SY255未缺失，反之就出现基因缺失现象，临床表现少精或无精。