[发明专利]一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地讲，属于ssDNA与蛋白质酶法交联的生物技术领域。

背景技术

DNA-蛋白质交联物是一种用途广泛的分子工具，当ssDNA与蛋白质交联后，可以利用序列互补的一条ssDNA，指导这些ssDNA-蛋白质交联物在空间的有序排布，因而具有广泛的用途。ssDNA-蛋白质交联物主要被应用于以下方面：（1）检测核酸或蛋白质；（2）制备生物芯；（3）制备具有定量关系的链亲和素网络；（4）构建多酶体系。

尽管ssDNA-蛋白质交联物有着非常广泛的应用，但是ssDNA-蛋白交联物的合成却较为困难。目前，制备ssDNA-蛋白质交联物的方法主要包括以下几种：（1）目标蛋白与链亲和素融合，ssDNA进行生物素化修饰，通过链亲和素与生物素的特异性相互作用而达到交联的目的；（2）目标蛋白表达出组氨酸标签（His），ssDNA进行适当修饰，借助Ni²⁺使彼此结合在一起，形成Ni-NTA-His6的形式；（3）借助辅因子作用重构不含辅基的蛋白（酶）为全酶（functional holoenzyme）实现交联；（4）完全采用化学交联，利用双功能试剂的交联作用；（5）利用特定的转移酶实现蛋白质的交联。以上已经报道的用于ssDNA与蛋白质交联的方法中，一般存在如下问题：（1）步骤繁琐。多涉及多次的纯化过程，步骤十分繁琐。多步的纯化会严重影响ssDNA-蛋白质交联物的产量。此外，繁琐的操作，也会使不稳定的酶不断失活，而最终失去应用的价值。（2）效率较低。基于化学偶联反应的交联方法，只有基团特异性（对应于特定氨基酸残基种类），无法保证特异性。因此，很难保证交联物的一致性，无法实现对特定位点的标记。（3）无法实现对多亚基蛋白的单亚基特异性偶联。许多蛋白是同型亚基组成的多聚体，传统的标记方法在通常情况下标记的结果是每个亚基都被标记，这在一定程度上增加了其活性受到标记影响的可能性。

来自噬菌体的蛋白质A*（proA*），是基因A内部包含的一个较小的阅读框编码的产物。生物化学研究表明，该蛋白质可以结合ssDNA，针对特定序列进行切割，并将切割后的ssDNA链通过与该蛋白中的酪氨酸残基通过形成酯键的方式连接起来。因此提供了一种借助酶、特异性标记蛋白质进行交联的可能。

鉴于现存的ssDNA-蛋白质交联反应存在的不足以及ssDNA-蛋白质交联物在各个方面有着广泛的应用，开发一种通用、简便、高效的ssDNA-蛋白质交联技术显得尤其必要。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种通用、简便、高效的ssDNA-蛋白质酶法交联方法。

本发明的第二个目的在于提供来源于噬菌体ΦX174的蛋白proA*（protein ID:NP_040704）在ssDNA-蛋白质酶法交联方法中的应用。

本发明的第三个目的在于提供ssDNA-蛋白质酶法交联方法在制备蛋白质和/或酶-ssDNA交联物中的应用。

为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备proA*与目标蛋白的融合蛋白，所述proA*（protein ID:NP_040704）来源于噬菌体ΦX174；

（2）融合蛋白与ssDNA交联，所述ssDNA含有识别和结合序列。

作为一个优选方案，步骤（1）中目标蛋白为乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)，制备LDH-A*融合蛋白包括以下步骤：

（1）构建含有LDH-A*融合蛋白基因的重组质粒pET28a-LDH-A*；

（2）将（1）构建的重组质粒转入宿主菌株得到重组菌；

（3）使用2×YT培养基进行发酵，使用终浓度为0.5mM IPTG进行诱导，在30℃的诱导温度下培养8小时；

（4）对发酵后的菌体超声破碎；

（5）使用Ni-NTA亲和柱进行融合蛋白的纯化，洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，400mM咪唑，pH7.4；

（6）收集洗脱峰样品进行透析处理，即制得LDH-A*融合蛋白。

为了获得理想的表达量，对培养基、表达条件等进行了初步的探索和优化，筛选出了最优培养基、表达条件等。采用SDS-PAGE电泳检测发现，在实验中，E.coli BL21(DE3)/pET28a-LDH-A*的表达产物融合蛋白LDH-A*，其中，可溶表达量达到25-35%。通过Ni-NTA亲和柱进行蛋白的纯化，最终制备LDH-A*融合蛋白。