[发明专利]一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法无效
| 申请号： | 201310261812.7 | 申请日： | 2013-06-27 |
| 公开（公告）号： | CN103361321A | 公开（公告）日： | 2013-10-23 |
| 发明（设计）人： | 王天文;马兴元;马飞;王平 | 申请（专利权）人： | 华东理工大学 |
| 主分类号： | C12N9/04 | 分类号： | C12N9/04;C12N15/70 |
| 代理公司： | 上海翼胜专利商标事务所(普通合伙) 31218 | 代理人： | 施春花;翟羽 |
| 地址： | 200237 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 ssdna 蛋白质 交联 方法 | ||
1.一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备proA*与目标蛋白的融合蛋白，所述proA*来源于噬菌体ΦX174；
（2）融合蛋白与ssDNA交联，所述ssDNA含有识别和结合序列。
2.根据权利要求1所述的一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，步骤（1）中目标蛋白为乳酸脱氢酶LDH，制备LDH-A*融合蛋白包括以下步骤：
（1）构建含有LDH-A*融合蛋白基因的重组质粒pET28a-LDH-A*；
（2）将（1）构建的重组质粒转入宿主菌株得到重组菌；
（3）使用2×YT培养基进行发酵，使用终浓度为0.5mM IPTG进行诱导，在30℃的诱导温度下培养8小时；
（4）对发酵后的菌体超声破碎；
（5）使用Ni-NTA亲和柱进行融合蛋白的纯化，洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，400mM咪唑，pH7.4；
（6）收集洗脱峰样品进行透析处理，即制得LDH-A*融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，构建pET28a-LDH-A*设计的引物如下：
为构建重组质粒pET28a-LDH设计如下引物：
LDH上游引物LF1:CTAGCTAGCATGGCAAGTATTACGGATAAGGATCACC；
LDH下游引物LF2:CCGCTCGAGTTACTGACGGGTTTCGATGTCG；
为构建重组质粒pET28a-LDH-A*设计如下引物：
LDH上游引物LAF1:CTAGCTAGCATGGCAAGTATTACGGATAAGG；
LDH下游引物LAF2:CCAGAGCCGCCGCCGCCAGAGCCGCCGCCGCCCTGACGGGTTTCGATGTCATTCTTAG；
proA*上游引物LAF3:TCTGGCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCTATGAAGAGCCGCCGTGGTTTTACGAT；
proA*下游引物LAF4:GCCCTCGAGTCATTTACCGCCCGCCGTCCACTTG。
4.根据权利要求1所述的一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，步骤（2）交联反应缓冲液的成分如下：4×：Tris-HCl200mM，NaCl600mM，DTT20mM，MgCl220mM，pH7.5。
5.根据权利要求1所述的一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，步骤（2）融合蛋白与ssDNA摩尔质量比为1：2。
6.根据权利要求1所述的一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，步骤（2）交联反应温度为37℃，时间为5-30min。
7.根据权利要求6所述的一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法，其特征在于，交联反应时间为10min。
8.来源于噬菌体ΦX174的蛋白proA*在ssDNA-蛋白质酶法交联方法中的应用，其特征在于，所述ssDNA含有识别和结合序列，蛋白proA*在二价金属离子的作用下在体外识别、切割并催化特定序列的ssDNA与自身酪氨酸残基Tyr通过形成酯键相偶联。
9.权利要求1所述的一种ssDNA-蛋白质酶法交联方法在制备蛋白质和/或酶-ssDNA交联物中的应用。
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