[发明专利]培养基、试剂盒及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及早期中胚层祖细胞和生血内皮细胞再生技术领域，具体地涉及培养基、试剂盒及其用途。更具体地，本发明涉及培养基、试剂盒、制备早期中胚层祖细胞的方法及利用本发明的试剂盒制备生血内皮细胞的方法。

背景技术

血细胞输注和造血干细胞移植是细胞治疗的常用方法，但其应用长期受制于供体来源紧缺的困扰，极大限制了该治疗手段的推广和应用。因而，寻找造血干细胞和成熟血细胞的新来源成为再生医学领域最受瞩目的研究方向之一。

人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）或诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）作为一类具备自我更新和无限增殖潜能的多能性细胞，具有向造血干细胞分化的潜能，为造血干细胞和成熟血细胞的再生及大量制备提供了令人兴奋的前景。然而，目前诱导hESCs/iPSCs分化为造血干细胞的方案存在诱导分化效率低、分化细胞功能差等不足，这给该技术的临床应用前景蒙上了阴影。hESCs/iPSCs向造血干细胞分化需要依次经历早期中胚层祖细胞及生血内皮细胞阶段，优化hESCs/iPSCs向这两个阶段细胞分化的方案，必然会提高这些细胞进一步向造血干细胞的分化效率，使分化细胞更好的发挥功能。

然而，目前体外诱导hESCs/iPSCs分化为早期中胚层祖细胞或生血内皮细胞的方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够用于体外诱导hESCs/iPSCs分化为早期中胚层祖细胞或生血内皮细胞的培养基、试剂盒及方法。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

目前已知人胚胎干细胞向造血细胞分化过程基本模拟造血细胞在体内发育的各个时期，即早期中胚层祖细胞阶段、生血内皮细胞阶段，并最终分化为造血干细胞和成熟的血细胞。因此，诱导人胚胎干细胞高效分化为早期中胚层祖细胞和生血内皮细胞是提高人胚胎干细胞向造血干细胞分化效率的关键环节。目前研究表明多种细胞因子和转录调控蛋白在人胚胎干细胞向造血干细胞诱导分化早期发挥重要作用。但是造血细胞在体内的分化和成熟是时间和空间层面上众多因素联合作用的结果，其中不仅包括细胞内众多信号通路和转录分子的调控，同时也涉及到细胞与微环境间的复杂的相互作用和反馈调节。

发明人通过研究发现，前列腺素E2（prostaglandin，PGE2）在人胚胎干细胞向造血干细胞分化早期阶段发挥重要角色。PGE2是人体内广泛存在的一种重要生长和调节因子。它是一类含有20个碳原子的不饱和脂肪酸，其基本骨架为一个五碳环和两条侧链，在体内由花生四烯酸（arachidonic acid，AA）经过氧化途径而生成。当机体细胞受到某些机械、物理或者化学刺激时，细胞的磷脂酶A2（phospholipase，PLA2）被激活，使与膜结合的AA游离，然后通过环氧合酶（COX-1或COX-2）作用转换为PGH2（prostaglandin H2），PGH2经细胞特异性酶作用迅速生成具有生物活性的前列腺素类介质。PGE2作为自分泌和旁分泌调节因子在正常机体内参与了免疫应答、急性期反应，维持血管的完整和张力，神经生长和发育以及造血调节等重要的生理过程。此外，有实验室利用斑马鱼和小鼠发育模型进行进一步研究发现PGE2作为一种重要的调控因子参与造血干细胞发育、增殖、归巢等过程中。

发明人的研究工作表明，PGE2在人胚胎干细胞向造血干细胞分化的早期，即早期中胚层祖细胞和生血内皮阶段发挥极其重要的调控作用。具体地，利用酶活性抑制剂或RNA干扰等手段阻断PGE2限速合成酶---环氧合酶的作用后，人胚胎干细胞向中胚层祖细胞和生血内皮细胞的诱导分化效率明显降低；而在诱导分化过程中添加PGE2能够有效增强人胚胎干细胞向早期中胚层祖细胞和生血内皮细胞分化的诱导效率。

由此，基于发明人的上述发现，本发明提供了能够用于体外诱导胚胎干细胞分化为早期中胚层祖细胞或生血内皮细胞的培养基、试剂盒及方法。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种培养基。根据本发明的实施例，该培养基包括：基础培养基，该基础培养基为SFDM培养基；PGE2以及BMP4（即骨形态发生蛋白4）。发明人惊奇地发现，利用本发明的上述培养基能够高效快速地诱导ESCs向早期中胚层祖细胞进行分化，从而能够有效地制备大量的早期中胚层祖细胞，进而能够有效地用于造血干细胞和成熟血细胞的诱导，从而能够应用于血液疾病的治疗。