[发明专利]转基因玉米品系MLPA检测的探针及制备长探针的引物

说明书

技术领域

本申请涉及核酸分子检测领域，特别是涉及一种用于转基因玉米品系MLPA检测的探针，制备该探针引物，以及该探针的应用。

背景技术

玉米转基因品系多，已知商业化的至少有64个单品系，我国已批准的品系有12个，它们分别是转基因玉米品系MOM810、BT176、BT11、GA21、T25、MON88017、NK603、MIR604、MON863、59122、TC1507和MON89034。美国和阿根廷是全球最大的两个玉米种植和出口大国，种植的玉米大部分，约80％以上都是转基因的，且品系多。2010年起我国从美国就进口了150万吨玉米，现逐年增加。因此，必须对进口玉米进行转基因品系检测。

我国现行的转基因玉米品系检测以常规的PCR技术为主，检测快速、灵敏度高、结果准确、可靠。然而，常规PCR方法单管只能分析一个基因，效率低。当前要对如众多转基因品种和品系的转基因玉米逐一筛查，工作量太大，成本高。因此，基因检测急需一种高通量检测方法。常见的高通量基因检测技术有基因芯片、多通道毛细管电泳和DHPLC分离技术等。然而，这些方法仍然是以常规的单重PCR或多重PCR为基础的，检测能力有限，以多重PCR为基础的基因芯片，需要多套引物进行扩增，操作步骤繁琐，并不适合大规模的高通量检测。

多重连接依赖探针扩增技术（Multiplex Ligation dependent Primers Amplification MLPA）由荷兰的Dr．Schouten JP于2002年报道,最初应用于医学检测目的。其原理是针对不同的感兴趣基因位点设计长度各不相同的探针对，探针对两序列的一端具基因特异性，它们与各自目标基因区域复性后，彼此之间没有碱基空隙，因此，在连接酶的作用下，探针对的两条探针可以，连接成一条完整的序列，与此同时所有探针对中与目的基因不杂交的一端都接有相同的碱基序列，既通用序列，用于PCR。这样当探针对与目标区特异性的复性后，并在连接酶的作用下相连成完整的探针序列，该完整的探针序列本身作为PCR扩增的模板，并由一对公用引物对各完整的探针序列进行扩增，从而放大检测信号，由于针对不同的感兴趣基因位点设计的探针对长度各不相同，经分离PCR产物大小，不须测序，便可知道是否有目标基因的存在，在并能进行相对定量分析。其中，探针中与目标基因区域复性的部分序列保障了探针的特异性。

MLPA技术包括探针的设计、探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分离及数据收集等过程。具有经济（不需昂贵设备）、特异性高(探针复性及连接酶识别)及高通量(单管可测多达40多个基因)的特点。此外，该法检测所针对的基因目标区可短至40-50bp,特别适于DNA高度降解样品的检测。至今，MLPA技术已应用于很多领域，如单核苷酸多态性和基因突变检测、基因片段缺失和重复、染色体数目异常、基因甲基化检测及mRNA分析等。目前，在转基因玉米品系的检测中尚没有比较完整的MLPA检测探针。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的转基因玉米品系MLPA检测的探针及其应用。

本申请的另一目的是提供一种适用于不对称PCR方法制备长探针的引物，该引物能够用于不对称PCR方法，制备出本申请的部分长探针。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：