[发明专利]一种可同时检测多个HBV耐药突变位点的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种COLD-PCR联合测序技术，属于基因突变检测领域。 

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)由于转录过程中由于缺乏严格的校正机制，核苷酸错配率高，在抗病毒药核苷(酸)类似物(nucleot(s)ide analogues, NA)的压力选择下，HBV逆转录酶区(reverse transcriptase, rt)易发生突变，即基因型耐药突变，并导致对抗病毒药物耐药。为提高HBV的治疗效果，更好地监测及减少耐药的发生，在用药过程中有必要监测慢性乙型肝炎（CHB）患者rt区是否存在突变。

    检测HBV基因突变的方法主要有测序法、反向杂交法(reverse hybridization assay) 、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、实时荧光定量PCR (real-time PCR)、限制性片段质谱多态性技术(restriction fragment mass polymorphism，RFMP)、超深度焦磷酸测序(Ultradeep Pyrosequencing, UDPS)、 基因芯片(gene chip)等。PCR直接测序法(sanger测序法)因其可一次性检测多个位点、可同时检测已知和可能的未知耐药变异位点、假阳性率低等优点被认为基因型耐药检测的金标准，但其灵敏性较差，只有当变异株超过HBV准种池20%时才能被发现，容易出现假阴性结果；反向杂交的灵敏度较高，约为5％，但其价格较贵，操作不够简便，尤其在发展中国家无法全面推广；PCR-RFLP及real-time PCR只能检测已知、单一位点的变异，随着多种核苷(酸)类似物的相继问世和HBV新的耐药变异位点的不断出现，这些方法将难以胜任；一些新的技术，如RFMP、UDPS和gene chip等技术逐渐得以应用，但是这些技术存在价格昂贵、操作繁琐、数据分析工作量大、存在碱基错配等缺点，较适合于研究目的，不太适合于临床应用。因此，探索建立实用、灵敏度高的耐药突变检测方法十分必要。

低变性温度共扩增PCR(coamplification at lower denaturation temperature PCR，COLD-PCR)是2008年最先由Li(Li J, Wang LL, Mamon H, et al. Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing. Nat Med 2008;14:579-584.)等报道的可提高sanger测序法灵敏度的一种PCR方法，其基于存在错配碱基的双链DNA熔解温度会发生改变的原理而建立的。根据突变后碱基是否使Tm温度下降可分为快速COLD-PCR(fast COLD-PCR)和完全COLD-PCR (full COLD-PCR)。由于COLD-PCR技术不需要昂贵的设备，仅通过体系条件的优化就可提高对突变株的检测灵敏度，其已广泛应用于肿瘤相关基因的突变检测，如p53、EGFR、k-ras、MPL等基因的检测，但未见用于检测HBV基因突变的报道。 

发明内容

为了克服上述检测HBV基因突变方法的缺点，本发明率先建立了高度灵敏、简便、价廉和实用的COLD-PCR法联合sanger测序技术，探讨将其应用于HBV的已知和未知耐药突变检测的可行性。

    本发明提供的技术方案为：

一种可同时检测多个乙型肝炎病毒耐药突变位点的检测方法，步骤为：

1）            设计和合成一对引物，如SEQ ID No.1-2所示；

2）            以乙型肝炎病毒DNA为模版，并以步骤1所述的一对引物为扩增引物进行扩增，测定扩增产物的熔解温度Tm；依据熔解温度Tm，通过改变扩增变性温度确定关键变性温度Tc；

3）            通过Tc建立COLD-PCR反应体系条件并反应得到COLD-PCR产物；

4）            将COLD-PCR产物进行sanger双向序列测定。

所述的COLD-PCR包括以下两种方式：fast COLD-PCR和full COLD-PCR。

fast COLD-PCR的反应条件为：

95℃预变性30s；95℃变性10s，56℃退火延伸30s，5个循环；Tc℃变性20s，56℃退火延伸30s，35个循环。