[发明专利]一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种龙脑的制备方法，尤其是一种从自然界中分离出的能催化蒎烯转化生成龙脑的微生物，并利用其制备龙脑的方法。

背景技术

我国是松节油和桉叶油等萜烯精油资源大国。近年，我国取消了松节油等天然精油原油的出口退税。这一政策的实施，有力地推进了天然精油手性化合物等高附加值产品的产业化进程。但是生产常采用硫酸、硼酐等作为催化剂，易燃易爆；草酸、醋酐为酯化剂，生产过程污染状况严重。因此，国内外很多研究人员，寄希望能从自然界微生物中分离出的能催化蒎烯转化生成龙脑的微生物，用于工业生产。

1994年，南京林业大学采用一株自行分离筛选得到的桔青霉NFU-901及其诱变株UV(O1)对a-蒎烯进行生物转化，发现a-蒎烯的转化产物主要是马鞭草烯醇（75%），而龙脑的含量只有2.4%和4%；2008年，广西大学刘幽燕等用特氏克雷伯氏菌(klebsiella planticola)菌株SM08411. ZJ0802A 1和E0802a和2%蒎烯作用生成乙酸龙脑酯，乙酸龙脑酯在微生物作用下，进行水解反应可获龙脑，但是该工艺耐受底物浓度低，主要用于乙酸龙脑酯微生物转化制龙脑，工业利用价值低 。

蒎烯是化学法合成龙脑时应用最广泛的原料。而以蒎烯为原料进行生物转化可以制备龙脑，说明自然界的微生物中存在能催化蒎烯转化生成龙脑的微生物。但是从现有文献报道中可以发现，龙脑往往只是作为转化产物中的一个副产物，因此产量都较低。若能寻找到能够专一性或选择性转化蒎烯生成龙脑的微生物，则以丰富的蒎烯为原料，通过生物转化的方法制备龙脑的产率将会大大地提高。

发明内容

本发明正是针对现有技术存在的不足，提供一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法。

为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：

一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法，所述方法依次包括以下步骤：

步骤一：菌种的筛选与鉴定

原始菌株筛选：从自然界中取富含松节油的土壤和松树皮、叶样品，将分离得到的各纯菌株分别接种到经灭菌处理，盛有100份查氏培养基液的容器中，于30℃，150r/min条件下摇瓶培养48h，然后各加入2%蒎烯，在相同条件下发酵培养30h后，用气相色谱仪分析发酵产物情况，以乙酸龙脑酯为目标物对比选出最为理想的菌株作为试验菌株；富集培养结束后，取培养液1mL用无菌水依次稀释至10倍、5倍、10倍、6倍后涂布平板，待菌落生长后，挑取不同的菌落进行平板划线分离纯化，并保藏纯化的单菌落菌株；

②菌株鉴定：根据菌株形态观察及生理生化试验结果以及16S rDNA序列同源性分析，结合《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰细菌鉴定手册》，确定菌株为革兰氏阴性菌，且与植生克雷伯氏菌最相似，结合分子生物学结果，确认菌株为植生克雷伯氏菌；

步骤二：菌种的诱导变异

步骤一所得的菌种依次采用下列等离子诱导和化学亚硝基胍诱变：

等离子诱导：取10mL菌液8000rpm/min离心10min，弃去上清液，用10mL生理盐水悬浮得菌悬液；取2ml菌悬液均匀涂布于等离子体装置的下电极介质上，电压24kV，电流1.7mA、间隙3mm的操作条件下照射0，10，15，20，30，50和70s，将处理过的菌液梯度稀释后，取1ml涂布于固体培养基平板上，37℃下蔽光培养2天，用平板菌落计数法进行活菌计数，绘制致死曲线，选取致死率70%~80%对应的时间为等离子体处理时间，进行一次冷等离子诱变，照射后立即稀释涂布在固体琼脂培养基上，30℃恒温下培养2天，挑选30个单菌落，进行后续化学诱变；

②化学亚硝基胍诱变：作用剂量为300~500ppm，诱变在pH5.0，0.1M的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中静息培养3h，然后稀释涂布在固体琼脂培养基上，30℃恒温下培养2天，挑选30个单菌落，从挑选的30个单菌落中，选择3株产率最高的菌株，进行蒎烯发酵试验，进而再从其中选择1株产率最高的菌株；固态托盘培养制成原曲；

步骤三：龙脑的制备