[发明专利]一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法

权利要求书

1.一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法，其特征是，所述方法依次包括以下步骤：

步骤一：菌种的筛选与鉴定

原始菌株筛选：从自然界中取富含松节油的土壤和松树皮、叶样品，将分离得到的各纯菌株分别接种到经灭菌处理，盛有100份查氏培养基液的容器中，于30℃，150r/min条件下摇瓶培养48h，然后各加入2%蒎烯，在相同条件下发酵培养30h后，用气相色谱仪分析发酵产物情况，以乙酸龙脑酯为目标物对比选出最为理想的菌株作为试验菌株；富集培养结束后，取培养液1mL用无菌水依次稀释至10倍、5倍、10倍、6倍后涂布平板，待菌落生长后，挑取不同的菌落进行平板划线分离纯化，并保藏纯化的单菌落菌株；

②菌株鉴定：根据菌株形态观察及生理生化试验结果以及16S rDNA序列同源性分析，结合《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰细菌鉴定手册》，确定菌株为革兰氏阴性菌，且与植生克雷伯氏菌最相似，结合分子生物学结果，确认菌株为植生克雷伯氏菌；

步骤二：菌种的诱导变异

步骤一所得的菌种依次采用下列等离子诱导和化学亚硝基胍诱变：

等离子诱导：取10mL菌液8000rpm/min离心10min，弃去上清液，用10mL生理盐水悬浮得菌悬液；取2ml菌悬液均匀涂布于等离子体装置的下电极介质上，电压24kV，电流1.7mA、间隙3mm的操作条件下照射0，10，15，20，30，50和70s，将处理过的菌液梯度稀释后，取1ml涂布于固体培养基平板上，37℃下蔽光培养2天，用平板菌落计数法进行活菌计数，绘制致死曲线，选取致死率70%~80%对应的时间为等离子体处理时间，进行一次冷等离子诱变，照射后立即稀释涂布在固体琼脂培养基上，30℃恒温下培养2天，挑选30个单菌落，进行后续化学诱变；

②化学亚硝基胍诱变：作用剂量为300~500ppm，诱变在pH5.0，0.1M的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中静息培养3h，然后稀释涂布在固体琼脂培养基上，30℃恒温下培养2天，挑选30个单菌落，从挑选的30个单菌落中，选择3株产率最高的菌株，进行蒎烯发酵试验，进而再从其中选择1株产率最高的菌株；固态托盘培养制成原曲；

步骤三：龙脑的制备

原曲用0.02mo1/L的Na₂HP0₄-KH₂P0₄缓冲液洗涤2次，再用同一缓冲液制成浓度2×10⁷cfu/ml菌悬液，5%定量接种于含有3%蒎烯的无机盐培养基中，在150r/min，30℃进行转化；底物采用多次加入的方式，反应在一个相对密闭的摇床中进行，在反应刚开始时，于培养液中加入3%的底物，转化24h后再加入2%底物和5%浓度2×10⁷cfu/ml菌悬液，再连续加入两次，最后一次加入1%底物和5%浓度2×10⁷cfu/ml菌悬液后继续反应需多于2d，生物转化反应共进行6d，发酵完成后，加入洗涤分离釜，上层蒸轻油，皂化蒸片，粗片重结晶即得龙脑。

2.如权利要求1所述的一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法，其特征是，所述步骤一原始菌株筛选中，查氏培养基液其成分按重量份为：

NaNO₃：     2g

K₂HPO₄：    1g

KCl：       0.5g

MgSO₄：    0.5g

FeSO₄       0.01g

蔗糖        30g

琼脂        15~20g

水          1000g。

3.如权利要求2所述的一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法，其特征是，所述查氏培养基液，在自然pH值、气压1.05kg/cm²、121.3℃环境下灭菌20分钟。

4.如权利要求1所述的一种利用自然界中分离出的酶制备龙脑的方法，其特征是，所述步骤二等离子诱导中，将得到的植生克雷伯氏菌用无菌生理盐水制备成孢子菌悬液，其孢子数控制在1×10⁶~2×10⁶个/ml之间。

5.如权利要求1所述的一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法，其特征是，所述步骤二化学亚硝基胍诱变中，原曲植生克雷伯氏菌菌含量≥5×10⁸cfu/g。