[发明专利]一种测定外生菌根真菌C、N、P相关胞外酶活性的方法

说明书

所属技术领域：

本发明涉及一种测定外生菌根真菌C、N、P相关胞外酶活性的方法，能够为探究外生菌根真菌影响土壤C、N、P循环的深层机制提供技术支持。

背景技术：

外生菌根真菌(Ectomycorrhizal fungi,ECM)是菌根真菌菌丝体侵染宿主植物尚未木栓化的营养根形成共生体。世界上约有5000种真菌与2000多种木本植物能形成外生菌根。宿主植物能够为ECM提供碳源，许多研究表明宿主植物通过光合作用产生的大约10%-30%的碳被用来供给ECM满足生长的需要，而与此同时，ECM通过分泌胞外酶水解一些复杂的有机化合物，为宿主植物提供所需的无机营养物,促进植物生根、生长及发育，增强植物抗病性、抗逆性。同时，也提高了土壤养分（尤其磷）的利用率，增强土壤活性，增加土壤有机质的含量，改善土壤理化性质，提高土壤肥力。一些研究报道菌根真菌能够发挥许多生态功能，如参与C循环、分解和吸收土壤有机质及矿物质的营养成分，通过真菌菌丝网络系统为植物体运输营养物质等，这明显促进了土壤C、N、P的循环。外生菌根真菌分泌C相关酶如羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、漆酶、多酚氧化酶、愈创木酚氧化酶和几丁质酶等，能够降解植物多糖(纤维素、半纤维素、淀粉等)、木质素以及一些动物产生的几丁质等。N相关酶如蛋白酶，蛋白酶能够在N源缺乏的情况下水解蛋白质，为真菌及植物体提供N源。P相关酶如酸性磷酸酶等，在土壤P代谢循环(形成无机P)中扮演非常重要的角色，常以磷酸盐的形式被植物和微生物吸收。本专利提供了一种测定外生菌根真菌C、N、P相关胞外酶活性的方法，旨为进一步探究外生菌根在生态系统中土壤营养循环的重要作用。

发明内容：

本专利的目的在于通过室内进行外生菌根真菌的纯化及液体培养，然后提取粗酶液进行C、N、P相关胞外酶活性的测定，为探究酶的分泌特征在土壤营养循环中的作用提供技术支持。

为了达到上述目的，本专利采用的技术方案包括：

1.外生菌根真菌的纯化和液体培养

将野外采集的外生菌根真菌，利用MMN固体培养基进行纯化培养，直至无杂菌产生为止。然后在无菌条件下将菌株接种到液体MMN培养基（去掉琼脂，0.3g·L^-1的酵母浸粉代替麦芽浸粉和葡萄糖再加入2种试剂来诱导酶的产生：1)2.5g·L^-1胶质几丁质来诱导几丁质酶的产生；2)5g·L^-1的羧甲基纤维素钠诱导纤维素酶的产生）培养15～20d。

2.真菌胞外粗酶液的制备及酶的测定

液体培养基培养15～20d后，将锥形瓶内的菌丝用4层纱布过滤，滤液置于离心管内，10000rpm·min^-1，4℃离心10min，上清液即为粗酶液。取一部分粗酶液煮沸10min，使酶失活作为对照组，然后进行C相关胞外酶（羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、漆酶、多酚氧化酶、愈创木酚氧化酶和几丁质酶）活性的测定、N相关胞外酶（蛋白酶）活性的测定，另外在无菌条件下取0.5g菌丝体至离心管中，分别添加2ml0.01mol·L^-1醋酸盐溶液(pH4.8)；2mL0.01mol·L^-1EDTA；2mL0.01%Triton X；2mL2.5%pvp混匀，4℃离心10min，上清液即为粗酶液，再取一部分粗酶液煮沸10min，使酶失活作为对照组，然后进行P相关胞外酶（酸性磷酸酶）活性的测定。

本发明的技术特征：

1.利用液体培养基培养外生菌根真菌，繁殖快，培养周期短。

2.采用室内控制实验，避免了野外试验客观影响因子的干扰。

3.每种测定方法都选用煮沸的粗酶液作对照，避免了其他客观因素的干扰。

具体实施方式：

下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。

1.真菌菌丝的纯化及液体培养