[发明专利]一种测定外生菌根真菌C、N、P相关胞外酶活性的方法

权利要求书

1.一种测定外生菌根真菌C、N、P相关胞外酶活性的方法，具体特征在于：1）外生菌根真菌的液体培养；2）真菌胞外粗酶液的制备；3）C相关胞外酶活性的测定方法；4）N相关胞外酶活性的测定方法；5）P相关胞外酶活性的测定方法。

2.根据权利要求1所述的一种测定外生菌根真菌C、N、P相关胞外酶活性的方法，其特征是：外生菌根真菌的液体培养：首先将真菌接种到MMN固体培养基上培养，反复继代，直至无杂菌产生，然后用MMN液体培养基（去掉琼脂）培养，0.3g·L^-1的酵母浸粉代替麦芽浸粉和葡萄糖，再加入2种试剂来诱导酶的产生：1)2.5g·L^-1胶质几丁质来诱导几丁质酶的产生；2)5g·L^-1的羧甲基纤维素钠诱导纤维素酶的产生，最后充分混匀分装培养基于锥形瓶中，高压灭菌20min(121℃，0.1Mpa)，冷却后无菌条件下接入菌株，标记后置摇床上（110r·min^-1、25℃）培养15～20d。

3.根据权利要求1所述的一种测定外生菌根真菌C、N、P相关胞外酶活性的方法，其特征是：真菌胞外粗酶液的制备：液体培养基培养15～20d后，将锥形瓶内的菌丝用4层纱布过滤，滤液置于离心管内，10000rpm·min^-1，4℃离心10min，上清液即为粗酶液，取一部分粗酶液煮沸10min，使酶失活作为对照组，然后进行C相关胞外酶（羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、漆酶、多酚氧化酶、愈创木酚氧化酶和几丁质酶）活性的测定、N相关胞外酶（蛋白酶）活性的测定，另外在无菌条件下取0.5g菌丝体至离心管中，分别添加2ml0.01mol·L^-1醋酸盐溶液(pH4.8)；2mL0.01mol·L^-1EDTA；2mL0.01%Triton X；2mL2.5%pvp混匀，4℃离心10min，上清液即为粗酶液，再取一部分粗酶液煮沸10min，使酶失活作为对照组，然后进行P相关胞外酶（酸性磷酸酶）活性的测定。

4.根据权利要求1所述的一种测定外生菌根真菌C、N、P相关胞外酶活性的方法，其特征是：C相关胞外酶活性的测定方法：1)羧甲基纤维素酶活性的测定：在试管中加入1%的羧甲基纤维素钠溶液（用pH4.60.1mol·L^-1醋酸缓冲液配置）0.9mL，加0.1mL的酶液，50℃条件下反应30min，取出后立即加入DNS试剂0.75mL，煮沸5min，待冷却后加8.25mL蒸馏水，充分混匀于520nm处测OD值，做3个平行测定取平均值，然后另取同量酶液，沸水浴煮沸10min灭活作为对照测定试验，以50℃条件下1h由底物产生1μmol的葡萄糖所需要的酶量为1个酶活力单位；2)β-葡萄糖苷酶活性的测定：取50μL 40mmol·L^-1的p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside作为底物加入到0.9mL0.01mol·L^-1醋酸盐缓冲溶液(pH5.5)中，再加50μL的酶液，45℃条件下反应30min，然后加3mL1mol·L^-1Na₂CO₃终止反应，于400nm处测OD值，做3个平行测定取平均值，另外取同量酶液，沸水浴煮沸10min灭活作为对照测定试验，以45℃条件下1h由底物产生1μmol对硝基苯所需要的酶量为1个酶活力单位；3)多酚氧化酶活性的测定：取0.1mol·L^-1的邻苯二酚0.25mL作为底物，加入2.0mL0.1mol·L^-1醋酸缓冲液(pH5.5)和0.75mL酶液，30℃条件下反应30min，立即于420nm处测OD值，做3个平行测定取平均值，然后另取同量酶液，沸水浴煮沸10min灭活作为对照测定试验，以1h内OD420值变化0.01为1个酶活力单位；4)漆酶活性的测定：取1mmol·L^-1的ABTS0.5ml作为底物，加2.0mL0.1mol·L^-1醋酸缓冲液(pH4.6)和0.2mL酶液，28℃下反应30min，立即于600nm处测OD值，做3个平行测定取平均值，然后另取等量酶液，沸水浴煮沸10min灭活作为对照组，以1h内OD600值变化0.01为1个酶活力单位；5)愈创木酚氧化酶活性的测定：取0.5mL80mmol·L^-1的愈创木酚(用pH4.60.1mol·L^-1醋酸缓冲液配置)作为底物，加3.0mL 0.1mol·L^-1醋酸缓冲液(pH4.6)和0.5mL酶液，置28℃条件下反应30min，立即于490nm处测OD值，做3个平行测定取平均值，然后另取等量酶液，沸水浴煮沸10min灭活作为对照组，以1h内OD420值变化0.01为1个酶活力单位；6)几丁质酶活性的测定：取1mL 1%的胶质几丁质加入到0.1mol·L^-1pH5.5的醋酸缓冲溶液中，加0.6mL的酶液，37℃条件下反应3h，再加0.75mL DNS试剂终止反应，煮沸10min，加1mL 18.2%的酒石酸钠，10000rpm·min^-1，4℃离心10min，于530nm处测OD值，做3个平行测定取平均值，然后另取同量酶液，沸水浴煮沸10min灭活作为对照测定试验，以37℃条件下1h由底物产生1μmolN-乙酰基-D-葡糖胺所需要的酶量为1个酶活力单位。