[发明专利]一种提高细菌多糖产量及粘度的培养方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种提高细菌多糖产量及粘度的培养方法。

（二）背景技术

细菌多糖是由细菌细胞分泌，由多个单糖单位或者衍生物经缩合、失水而连接起来的多聚物。细菌多糖主要以三种形式存在于自然界中:粘附在细胞表面上、分泌到培养基中或者组成细胞组分。根据重复单位的不同，多糖一般可以分为均多糖和杂多糖，前者只含有一种单糖，后者含有两种或两种以上的单糖。细菌多糖是细菌发酵产生，因此与动植物多糖相比，其生产受季节、地域和病虫害等地理环境、气候、自然灾害等因素的影响较小，生产周期短，产量及质量都很稳定，性价比较高。同时细菌多糖具有独特的结构及优良的理化性能，因此，在医药、食品、化工、石油开采，环境保护及其他领域具有广泛的应用。

在所有的各种细菌胞外多糖之中，结冷胶及黄原胶是两种商业开发最成功的多糖。黄原胶是由野油菜黄单胞菌（Xanthomnas campestris）发酵产生的胞外多糖。其结构是由β—(1→4)键连接的葡萄糖主链与三糖单位的侧链组成；侧链由甘露糖、葡萄糖醛酸和甘露糖组成。连接主链的甘露糖被乙酰化，末端甘露糖的羟基与丙酮酸的羰基形成缩醛。结冷胶是由鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas elodea）经好氧发酵所产的胞外多糖。是由3种单糖重复聚合组成的线性阴离子多糖，即:2分子D－葡萄糖，1分子D－葡萄糖醛酸和1分子的L－鼠李糖，在它的天然结构中，第一个葡萄糖分子的C2及C6分别被乙酰基及甘油酰基取代。黄原胶和结冷胶已先后被美国FDA及其他多个国家允许可作为食品添加剂使用。

但是由于当前多数多糖产生菌的产量相对较低，生产成本较高，并且其粘度较低，在一定程度上影响了其应用价值。当前的研究热点是通过各种方法增加产量提高应用价值。许多研究者通过对多糖生物合成途径相关基因的改造，提高了多糖产量。但是由于结冷胶及黄原胶等作为食品添加剂，如果其生产菌株为基因工程改造菌株，会引起消费者对其安全性的担忧。并且有些多糖的生物合成途径的相关基因未被阐明，无法通过基因工程手段对其进行改造。也有研究用物理或者化学诱变剂对生产菌株进行处理，但是由于此类诱变剂对细胞损伤较大，因此得到高产高粘度菌株的正变率较低，筛选效率低下。因此，迫切需要一种具有普遍性的非基因工程的高效方法，对生产菌株进行改造，筛选能生产具有更高产量及更高粘度的多糖生产菌株。

许多细胞在抗生素如氨苄青霉素的作用下，能产生活性氧，从而损伤DNA，产生突变。因此，氨苄青霉素也可被认为是一种较温和的诱变剂。另外，虽然各种细菌多糖具有各种不同的结构及单糖组成，但是除了少数几种多糖外，其他大部分细菌胞外多糖的生物合成途径中的第一步与细菌细胞壁肽聚糖的具有相似之处。胞外多糖合成的第一步是将活化的核苷糖（NDP-sugars）与细胞膜上的脂载体连接，然后逐步加成其他的核苷糖，完成重复单元的组装。这一生物合成的过程与细菌细胞壁组成成分肽聚糖的合成相似。而肽聚糖的合成过程能被抗生素氨苄青霉素抑制。为了在氨苄青霉素的抑制下进行增殖，细胞需合成更多的脂载体和活化的核苷糖。因此对氨苄青霉素具有抗性的细胞，可能具有更强的脂载体及活化的核苷糖合成能力，因此在无抗生素存在的条件下，这些多合成的底物也能被用来合成多糖，提升了氨苄青霉素抗性菌株的多糖合成性能。因此，氨苄青霉素可以用来作为一种诱变剂，促进细胞产生突变，同时也是一种促进细胞合成更多多糖的胁迫因子。

（三）发明内容

本发明的目的是利用氨苄青霉素可同时作为诱变剂及细菌细胞壁肽聚糖合成的胁迫因子的特性，提供一种提高不同细菌多糖产量及粘度的培养方法，连续传代培养中细菌多糖产生菌逐步提高氨苄青霉素的含量从而提高对细菌细胞的刺激，进一步可用于筛选高产高粘度的细菌多糖产生菌。

本发明采用的技术方案是：

一种提高细菌多糖产量及粘度的培养方法，所述方法包括：

（1）选取产胞外多糖的细菌作为待培养菌株，测定氨苄青霉素对该菌株的最小抑菌浓度，记为MIC；

（2）将待培养菌株接种至适宜的液体培养基中，添加浓度为此菌株对应MIC的1/3～2/3浓度的氨苄青霉素，于30℃、200rpm培养24h，所得培养液以10%体积比的接种量，转接于添加相同浓度氨苄青霉素的液体培养基中于相同条件下进行培养；所述液体培养基为常规适用于传代培养产胞外多糖菌株的液体培养基；

（3）重复步骤（2）的操作，在该氨苄青霉素浓度下共转接培养5次；