[发明专利]一种富集分离人外周血CD34+和CD91+淋巴细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体是涉及基于纳米磁珠的CD34⁺和CD90⁺干细胞分离方法。

背景技术

干细胞分离和纯化是研究干细胞各种生物学特性的基本手段，有潜在的临床治疗价值。目前认为CD34⁺细胞是较早期的干细胞，但CD34⁺细胞是异质性的，其中多能干细胞只占一小部分，更原始的部分应该是CD34⁺/CD90⁺等。纯化出这些更原始的部分进行体外培养，才能更加真实地了解原始造血干细胞的特性和增殖、分化特征。然而，正常人外周血中CD34⁺和CD90⁺干细胞的含量很低，现有方法还无法对外周血中痕量CD34⁺和CD90⁺干细胞直接分离和采集。因此，建立一种高效分离和纯化人外周血中CD34⁺和CD90⁺干细胞的方法，并对其进行表型及生物学功能鉴定，为更好的研究CD34⁺和CD90⁺干细胞的功能提供基础。

免疫磁分离技术是外周血细胞快速分离富集技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、浓缩人外周血样品中靶细胞，提高靶细胞检测灵敏度。近年来，基于磁性微珠的免疫磁分离法（IMS）是将抗体连接到磁珠上，然后再将连有抗体的磁珠投入样品液中对目标细胞进行捕获、富集以及磁分离（具体原理见图2A）。然而，目前基于微米级免疫磁珠的分离技术存在诸多局限性：1）与纳米磁珠相比，微米磁珠的比表面积相对较小，降低了磁珠捕获效率；2）由于微米磁珠自身的颗粒性质，其与细胞之间通过多相反应（multiphase reaction）结合，通常需要更长的时间去特异性捕获食品基质中的细胞；3）微米磁珠单分散性较差，在外周血基质中容易发生自身聚集或形成沉淀；4）传统的免疫磁分离技术，往往是将抗体直接偶联于免疫磁珠上，此操作常常会引起抗体活性大幅度降低以及导致抗体的空间方向发生改变，并增大了抗体间的空间位阻效应，从而降低了抗体的捕获效率5）血液粘稠度高并且其中非CD34⁺和CD90⁺干细胞的血细胞浓度大，微米磁珠容易产生非特异性吸附，难以实现对血液中CD34⁺和CD90⁺干细胞的特异性分离；6）微米磁珠的浓度过高会造成CD34⁺和CD90⁺干细胞的破损（磁场导致细胞表面磁珠互相吸引，使细胞受到挤压甚至破裂），导致分离的失败；7）磁珠偶联抗体时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的抗体联接在磁珠表面。抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种捕获效率高、简便分离时间短，低梯度磁场下（小于30 T/m）复杂的外周血基质中CD34⁺和CD90⁺干细胞特异性快速分离的方法。包括如下步骤：

一种富集分离人外周血CD34⁺和CD91⁺淋巴细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）每取1.0 mg多臂井星聚合物溶解于2 mL，0.02 M，pH 6.5 PBS，加入0.6 mg NHSS，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；取2.14 mg 鼠抗人CD34⁺抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得多臂井星聚合物-鼠抗人CD34⁺抗体复合物。

（2）每取1.0 mg多臂井星聚合物溶解于2 mL，0.02 M，pH 6.5 PBS，加入0.6 mg NHSS，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；取2.14 mg 鼠抗人CD90⁺抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥；