[发明专利]一种富集分离人外周血CD34+和CD91+淋巴细胞的方法

权利要求书

1.一种富集分离人外周血CD34⁺和CD91⁺淋巴细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）每取1.0 mg多臂井星聚合物溶解于2 mL，0.02 M，pH 6.5 PBS，加入0.6 mg NHSS，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；取2.14 mg 鼠抗人CD34⁺抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得多臂井星聚合物-鼠抗人CD34⁺抗体复合物；（2）每取1.0 mg多臂井星聚合物溶解于2 mL，0.02 M，pH 6.5 PBS，加入0.6 mg NHSS，0.4 mg EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；取2.14 mg 鼠抗人CD90⁺抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥；（3）每取22.5 mg 长链生物素，5.4 mg NHSS，3.6 mg EDC溶解于3 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；将0.8 mg多臂井星聚合物-抗体复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得相应长链生物素-多臂井星聚合物-抗体复合物；（4）富集捕获：取待测样品溶液1mL，加入0.1 mg 长链生物素-多臂井星聚合物-CD34⁺抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD34⁺细胞抗原复合物；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架充分分离；磁分离后，用等体积的PBS溶液重悬细胞，即为CD34⁺细胞；将分离后的上清液用等体积的PBS溶液洗涤，离心300rpm/min，20℃ 10 min，弃去上清，用等体积的PBS溶液重悬细胞；加入0.1 mg 长链生物素-多臂井星聚合物-CD90⁺抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD90⁺细胞抗原复合物；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，将离心管插入常规磁力架充分分离，即得到CD90⁺细胞；（5）去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液混重悬即得富集有CD34⁺或CD90⁺细胞的复合物即纳米磁珠-链霉亲和素-生物素-多臂井星聚合物-抗体-CD34⁺或CD90⁺细胞抗原。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述多臂井星聚合物为多臂井星化聚酰胺-胺，其分子量为 70000 Da。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述修饰了链霉亲和素的纳米磁珠粒径为20-50 nm ，优选为30 nm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）所述外周血干细胞的采集的方法包括如下步骤：用COBE.Spectra.AutoPBMC^TM干细胞采集仪，输入病人身高、体重、红细胞压积，液体参数：起始液体为1000 mL 9 g/L NaCl，血浆收集体积和干细胞收集体积均设为100 mL，起始抗凝剂比例1:13，收集速度50 mL/min。