[发明专利]一种构建野生番茄里基茄再生体系及遗传转化体系的方法

说明书

技术领域

本发明涉及遗传转化领域，具体地，涉及一种构建野生番茄里基茄再生体系及遗传转化体系的方法。 

背景技术

番茄是一种世界性茄科经济作物，野生番茄里基茄是现代栽培番茄的野生近缘种，其自然生长环境特殊、地理分布范围狭窄，仅存于南美洲的智利和秘鲁，濒临灭绝。然而其生物生长量巨大而快速，特别是其丰富的野生基因资源，是现代栽培番茄抗性与杂交育种和品种改良的宝贵基因来源。目前国内外对茄科植物尤其是番茄的研究，多集中于番茄的常规杂交育种、番茄与病原菌互作机理、番茄红素和番茄碱合成与代谢、番茄耐热性、耐盐性以及番茄发育分子生物学等方面，而对番茄的野生近缘种里基茄的再生与遗传转化体系的构建方法，尚未见系统报道。 

里基茄是现代栽培番茄的野生近缘种，栽培番茄的DNA水平遗传多样性还不足其5%。其再生体系及遗传转化体系的构建不能简单地借鉴栽培番茄的相关研究成果，对于推进番茄分子育种的进程至关重要，具有显著的创新性和重大现实意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种构建野生番茄里基茄再生体系的方法。 

本发明的再一目的是提供一种构建野生番茄里基茄遗传转化体系的方法。 

根据本发明的构建野生番茄里基茄再生体系的方法包括以下步骤： 

（1）里基茄无菌苗的培养； 

（2）在愈伤诱导培养基CIM（Callus induction medium）中诱导里基茄的根、茎（无腋芽）和叶三种不同外植体产生愈伤组织与丛生芽点，其中愈伤诱导培养基CIM的配方为：MS盐+B5有机+20mg/L甘露醇+0.2mg/L玉米素+1.2mg/L生长素+30g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，pH5.8； 

（3）将诱导出的丛生芽进行单株分离，转入无菌苗培养基SSCM2（Sterile seedling culture medium2）中诱导生根成苗。 

根据本发明的构建野生番茄里基茄遗传转化体系的方法包括以下步骤： 

（1）里基茄无菌苗的培养； 

（2）对里基茄的三种外植体分别进行农杆菌侵染与共培养，其中共培养培养基CCPM（Co-culture/Preservation medium）的配方为：MS盐+B5有机+120mg/L肌醇+120mg/L磷酸二氢钾+0.8mg/L盐酸硫胺素+0.25mg/L2,4-D+0.15mg/L激动素+20mg/L甘露醇+30g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，pH5.8； 

（3）将共培养后的外植体转入筛选培养基SCM1（Selective culture medium1）中进行抗性芽筛选，抗性芽培养成实生苗； 

（4）炼苗、驯化与移栽。 

根据本发明的构建野生番茄里基茄再生体系的方法，其中，在步骤（1）中，选择健康饱满的里基茄种子，用75%（v/v）的乙醇和2.5%的次氯酸钠消毒，4℃低温催芽，25℃黑暗孵育，然后于25℃，16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m^-2s^-1的组培条件下进行培养。 

根据本发明的构建野生番茄里基茄再生体系的方法，其中，在步骤（2）中，选取根、茎和叶三种外植体，置于愈伤诱导培养基上，然后于25℃，16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m^-2s^-1的组培条件下进行培养，每月更换一次培养基。 

根据本发明的构建野生番茄里基茄再生体系的方法，其中，在步骤（3）中，选择长度为1-2cm的丛生芽进行单株分离，转入无菌苗培养基SSCM2中诱导生根成苗，然后于25℃、16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m^-2s^-1的组培条件下进行培养，每月更换一次培养基。 

根据本发明的构建野生番茄里基茄遗传转化体系的方法，其中，在步骤（1）中，选择健康饱满的里基茄种子，用75%（v/v）的乙醇和2.5%的次氯酸钠消毒，4℃低温催芽，25℃黑暗孵育，然后于25℃、16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m^-2s^-1的组培条件下进行培养。