[发明专利]一种新型转基因质粒载体及其构建方法、体内含新型重组基因家蚕的培育方法

说明书

技术领域

本发明属于农业昆虫优良品种培育利用领域，具体涉及一种新型重组基因家蚕培育方法领域。

背景技术

作为一种天然材料，蚕丝在生物医学领域有着强劲的优势，如生物相容性，安全性，可降解性，良好的机械性能等。蚕丝作为医用材料有着很多的要求，也会产生一些局限，例如作为组织工程支架，它的降解速率要求和组织细胞的生长速率相一致，但是现有蚕丝不能更好地被控制在合适的时间里被降解；作为药物输送体系，药物作用部位对蚕丝本身的识别性很低，如果蚕丝具有更好的导向作用将在药物输送过程中发挥更大的作用；当蚕丝参与肿瘤等疾病的治疗过程中，作为传感器，快速的反应时间还需要进一步的探索研究。目前使用的蚕丝多为天然蚕丝，而从基因水平利用转基因技术对蚕丝蛋白进行改造，使改造后的蚕丝蛋白具有更好的生物相容性，降解性以及特有的药物输送靶向性等特性将有着很好的潜在价值。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）是降解细胞外基质(extra-cellular matrix,ECM)的最重要的酶系，占ECM降解酶总活性的70%以上，MMPs的活化被认为是ECM降解的限速环节。利用MMPs酶切位点可被MMPs酶切的特点，已有相关技术创新出现，如黄迪南等的发明专利：基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白及制备（专利申请号：2007100280375）。但目前还没有关于将MMPs酶切位点引入重组丝素重链蛋白，构建新型家蚕丝素的报导。目前对家蚕丝素改性的方法有物理方法，如将蚕丝制成微球/纳米颗粒等，但物理方法改性不能改变丝素的生物化学特性。也有化学方法，如丝素蛋白的接枝改性等。化学方法对家蚕丝素进行加工改性，需要消耗更多的能源，甚至造成环境污染。

发明内容

本发明的目的在于培育一种新型转基因家蚕，这种新型转基因家蚕具有一种重组的丝素重链蛋白基因，并且这种重组丝素重链蛋白含有MMP酶切位点，解决化学方法耗能多，环境污染问题，物理方法不能改变丝素的生物化学特性问题

发明技术方案：本专利将MMP酶切位点引入到重组丝素重链蛋白基因中，构建一种新型家蚕转基因质粒载体，并将这种新型载体采用显微注射法注入到产下一定时间内的蚕卵中，通过观察蚕蛾眼部的荧光现象鉴定转基因是否成功，培育一种新型转基因家蚕，这种新型转基因家蚕的培育方法将成为用生物学方法改造家蚕丝素，使家蚕丝素蛋白具有MMP酶切位点的基础技术，达到丝素改性的目的。

本发明第1个目的是采用基因克隆技术构建一种新型家蚕转基因质粒载体，这种质粒载体具有一种重组的丝素重链蛋白基因，并且这种重组丝素重链蛋白含有MMP酶切位点，通过以下方案实现：

首先采用乙醇沉淀法提取家蚕（菁松）基因组，然后利用设计的引物PCR扩增出家蚕重链N端和C端基因序列片段,接着运用pMD-18T simple载体连接技术，PCR技术，酶切技术，T4DNA连接酶技术构建新型家蚕转基因质粒载体（构建流程图见图1）。

本发明第2个目的是将已构建的新型家蚕转基因质粒载体采用显微注射法注入到产下一定时间内的蚕卵中，通过观察蚕蛾眼部的荧光现象鉴定转基因是否成功，培育一种新型转基因家蚕，这种家蚕基因组具有一种重组的丝素重链蛋白基因，并且这种重组丝素重链蛋白含有MMP酶切位点，通过以下方案实现：

首先将已构建的新型家蚕转基因质粒载体pBac[3×P3-EGFPafm]-FibH-GS-site与Piggybac Help Plasmid进行等量混合，采用显微注射法将混合质粒注入产下一定时间内的蚕卵中。通过观察后代蚕蛾眼部的荧光现象鉴定转基因是否成功，并通过基因组PCR法及测序鉴定获得新型转基因家蚕。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供的技术中将家蚕（菁松）基因组中丝素重链的N端和C端基因以及基质金属蛋白酶的酶切位点基因序列克隆进piggyBac载体中，采用显微注射的方法进行家蚕蚕卵的转基因，达到了培育一种新型转基因家蚕的效果。这种新型转基因家蚕具有一种重组的丝素重链蛋白基因，并且这种重组丝素重链蛋白含有MMP酶切位点。

2、本发明提供的技术中将眼特异启动子3×P3启动子调控下转录的绿色荧光蛋白基因置于piggyBac载体中与重组丝素重链蛋白基因一同转入家蚕蚕卵中。达到了直观分离培育成功的新型转基因家蚕的效果。

3、生物学方法改造家蚕丝素，可减少丝素产品加工的步骤，从而减少能源的消耗。

附图说明