[发明专利]一种新型转基因质粒载体及其构建方法、体内含新型重组基因家蚕的培育方法

权利要求书

1.一种新型家蚕转基因质粒载体，其特征在于，质粒载体含有重组丝素重链蛋白基因，重组丝素重链蛋白含有基质金属蛋白酶（MMPs）酶切位点。 

2.根据权利要求1所述的一种新型家蚕转基因质粒载体，其特征在于，质粒载体为PiggyBac转座子载体。 

3.根据权利要求1所述的一种新型家蚕转基因质粒载体，其特征在于，PiggyBac转座子含有眼特异启动子3×P3启动的绿色荧光蛋白基因。 

4.一种新型家蚕转基因质粒载体构建方法，其特征在于，步骤如下： 

A：采用沉淀法提取家蚕基因组； 

B：PCR扩增丝素重链蛋白基因目的序列； 

C、构建新型家蚕转基因质粒载体。 

5.根据权利要求4所述的新型家蚕转基因质粒载体构建方法，其特征在于，PCR扩增丝素重链蛋白基因目的序列过程，先PCR引物设计，以家蚕（菁松）基因组为模板，利用Primer Premier5.0设计引物，引物中含有MMPs酶切位点序列。

6.根据权利要求4所述的新型家蚕转基因质粒载体构建方法，其特征在于，构建新型家蚕转基因质粒载体，其载体构建方法如下： 

（1）构建质粒：将引物Fib-H-p1和Fib-H-p2的PCR产物直接连接至pMD-18T simple载体中，构建质粒pMD-FibH-N； 

（2）制备感受态细胞； 

（3）转化、存菌； 

（4）质粒提取； 

（5）DNA的琼脂糖凝胶电泳及胶回收； 

（6）对提取好的质粒pMD-FibH-N和经琼脂糖凝胶电泳及胶回收的PCR产物FibH-GS-site-C进行双酶切；酶切后胶回收FibH-N序列和FibH-GS-site-C序列，并用T4DNAligase连接； 

（7）第6步连接产物胶回收后以引物对Fib-H-p1和Fib-H-p4PCR扩增含MMPs酶切位点的重组丝素重链蛋白基因； 

（8）对第7步PCR产物的胶回收产物和转基因载体质粒pBac[3×P3-EGFPafm]进行双酶切； 

（9）酶切后胶回收目的序列，并用T4DNA ligase连接，构建新型家蚕转基因质粒载体，并将连接产物转化至感受态细胞中。 

7.一种新型转基因家蚕的培育方法，其特征在于，将已构建的新型家蚕转基因质粒载体采用显微注射法注入到产下一定时间内的蚕卵中，通过观察蚕蛾眼部的荧光现象鉴定出已经成功进行转基因的家蚕，并通过基因组PCR法及测序鉴定获得的转基因家蚕进行培育，其步骤如下： 

（1）质粒提取：将已构建的PiggyBac转座载体提取待用； 

（2）显微注射：将PiggyBac转座载体注入蚕卵内的方法是在PiggyBac转座子载体与Help质粒混合后，以0.4μg/μl注射到非滞育的早期胚胎中； 

（3）家蚕饲育； 

（4）荧光筛选：筛选具有PiggyBac转座载体的家蚕； 

（5）转基因蚕蛾的PCR扩增测序：进一步检测筛选出的家蚕是否具有转基因。 

（6）家蚕培育：对具有转基因的家蚕进行常规培育。 

8.根据权利要求7所述的新型转基因家蚕的培育方法，其特征在于，PiggyBac转座子载体与Help质粒体积比例为1：1。 

9.根据权利要求7所述的新型转基因家蚕的培育方法，其特征在于，注射量为15-20ng（10-15nl）DNA。 

10.根据权利要求7所述的新型转基因家蚕的培育方法，其特征在于，早期胚胎为产卵后1～3h。