[发明专利]蛔虫卵PCR-DHPLC检测引物、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品和农副产品中四种蛔虫卵的检测方法，尤其涉及利用PCR及变性高效液相色谱（DHPLC）技术检测食品和农副产品中四种蛔虫卵的方法。还涉及检测所使用的组合物，即试剂盒。

背景技术

食品和农副产品中的有害生物主要包括细菌、病毒和寄生虫，据世界卫生组织1999年公布的人兽共患病中，有人兽寄生虫共患病58种，据解放军第四军医大学在2004年4月-2005年2月调查我国人兽寄生虫共患病91种。人兽共患寄生虫病，对公共卫生、人民健康、社会安定均带来严重的威胁和危害。

似蚓蛔线虫（Ascaris lumbricoides Linnaeus）简称蛔虫，属于线形动物门线虫纲，主要有人蛔虫、猪蛔虫、鸡蛔虫和犬弓首蛔虫等。蛔虫分卵、幼虫及成虫三个发育阶段，是人体最常见的寄生虫，成虫寄生于小肠，可引起蛔虫病。其幼虫能在人体内移行，引起内脏幼虫移行症。虫卵随粪便排出体外，在潮湿、荫蔽、氧气充分的泥土中，在适宜温度下，发育为感染期虫卵，感染人体。

蛔虫的分布呈世界性，尤其在温暖、潮湿和卫生条件差的地区，人群感染较为普遍。蛔虫感染率，农村高于城市；儿童高于成人。目前，我国多数地区农村人群的感染率仍高达60％～90％。据1988～1992年全国寄生虫病调查结果：全国共调查658934人，蛔虫平均感染率为44.91%，最高可达71.12%，而在一些环境卫生极差的农村地区感染率更高。我国曾报道蔬菜携带蛔虫虫卵的情况并引起蛔虫病暴发的情况，国内曾有人群因生食带有感染期卵的甘薯、胡萝卜、瓜果、生菜、泡菜等腌菜后，引起暴发性蛔虫性哮喘的报道，说明蛔虫非常容易污染蔬菜。

我国对食品中蛔虫卵的检测技术仍处于比较落后的阶段，检验方法还只限于传统的显微镜检和离心集卵法，检测步骤繁琐，方法灵敏度低；结果判断主要依据形态学检验，对于检验人员专业能力要求高且易受主观经验影响。采用ELISA方法检测寄生虫卵，特异性差、易出现假阳性。PCR-凝胶电泳检测方法虽然检测成本低，但反应产物电泳处理极易造成污染；特异性强，灵敏度高的实时荧光PCR方法，也存在检测成本较高，荧光探针保存时间较短等问题。

变性高效液相色谱（DHPLC）采用离子对反相高效液相色谱的原理，是通过使用特殊的耐高温液相色谱分离柱同时采用温度调控的方式，对核苷酸片段分子进行分析分离的方法。该技术的发明为生命科学领域里的核酸分析提供了方便实用的技术平台。其快速高通量、全自动化操作、准确充高、重复性好及敏感性高的优点使其在核酸分析中具有无可替代的优势。该技术在已知和未知基因突变的检测和筛选、基因分型、基因定量和长度多态性分析等领域已经得到广泛应用。PCR-DHPLC检验蛔虫卵标准方法的建立，为控制该寄生虫的危害，保障食品安全，提供了有力保障。

发明内容

为了解决上述实际问题，本发明即旨在利用PCR和DHPCL技术，针对食品和农副产品中四种蛔虫卵建立引物对，以及灵敏便捷的检测方法，并建立应用于该方法的快速检测试剂盒。涉及应用通用型引物，同时检测人蛔虫卵、猪蛔虫卵、鸡蛔虫卵和犬弓首蛔虫卵共四种蛔虫卵。对于扩增片段长度相同的人蛔虫卵和猪蛔虫卵，使用部分变性DHPLC分析方法，分别鉴别出人蛔虫卵和猪蛔虫卵。本发明运用通用引物PCR结合DHPLC技术进行人蛔虫卵、猪蛔虫卵、鸡蛔虫卵和犬弓首蛔虫卵4种蛔虫卵的同时检测。应用本发明的试剂盒，4种蛔虫卵可以用一对引物就检测出来；在本发明的非变性DHPLC分析条件下，通用引物从样品中检测出4种蛔虫卵；在本发明的部分变性DHPLC分析条件下，进行扩增片段长度相同的人蛔虫卵和猪蛔虫卵的分离鉴定；分别检测出4种蛔虫卵。通用引物PCR反应克服了单一PCR反应中操作比较繁琐，交叉污染机会较多等缺点，可以在一个反应体系中同时扩增多个目的基因，操作简便快速。在一次操作过程中同时检测4种蛔虫卵，使得蛔虫卵的检测时间、检测数量和检测水平上都发生了很大的飞跃。与传统的蛔虫卵检测及鉴定方法如形态学鉴定、免疫学技术、PCR-凝胶电泳等检测方法相比，极大的缩短了操作的时间，而且大大降低假阳性和假阴性结果的出现，使得结果更加准确、可靠。

本发明的技术方案为：提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用蛔虫卵的特异性检测引物进行PCR扩增，再用DHPLC技术采集目的基因的图谱信息，直接从图谱信息读取蛔虫卵的检测结果，在此基础上，本发明还对此方法进行了特异性和灵敏度检测；其具体操作步骤如下：

本发明的一方面在于：提供一种蛔虫卵检测引物，具体为以下碱基序列：