[发明专利]蛔虫卵PCR-DHPLC检测引物、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种蛔虫卵PCR-DHPLC检测引物，其特征在于包括碱基序列：上游引物SEQ ID NO.1；下游引物SEQ ID NO.2。

2.一种蛔虫卵检PCR-DHPLC测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述引物SEQ ID NO.1～2。

3.根据权利要求2所述的蛔虫卵PCR-DHPLC检测试剂盒，其特征在于：包括浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；

其中，所述的PCR反应液由权利要求1所述引物SEQ ID NO.1～2各10μM、Tris·HCl10mM、KCl50mM、MgCl₂25mM、dNTP各2.5mM组成。

4.一种食品和农副产品中蛔虫卵的PCR-DHPLC检测方法，其特征在于：包括利用权利要求2所述的蛔虫卵检测试剂盒，对样品DNA进行PCR方法检测。

5.根据权利要求4所述的食品和农副产品中蛔虫卵的PCR-DHPLC检测方法，其特征在于：所述对样品DNA进行PCR方法检测的步骤包括：

①PCR反应体系为20μL，其中：

②步骤①的混合物5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增：94℃预变性5min；进入循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终止延伸5min。

6.根据权利要求5所述的食品和农副产品中蛔虫卵的检测方法，其特征在于：还包括以下操作步骤：

①在非变性条件下分析权利要求5所述方法获得的PCR产物，DHPLC条件如下：

色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相：0bp,55.0%缓冲溶液A，45.0%缓冲溶液B，

        100bp，50.2%缓冲溶液A，49.8%缓冲溶液B，

        375bp，37.8%缓冲溶液A，62.2%缓冲溶液B，

        650bp，34.6%缓冲溶液A，65.4%缓冲溶液B，

        925bp，33.2%缓冲溶液A，66.8%缓冲溶液B，

        1200bp，32.4%缓冲溶液A，67.6%缓冲溶液B；

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物10μL；

②部分变性条件下分析权利要求5所述方法获得的PCR产物，以鉴别出扩增片段长度相同的人蛔虫卵和猪蛔虫卵，DHPLC条件如下：

色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：60℃；

流动相：0.0min，50.3%缓冲溶液A，49.7%缓冲溶液B，

        0.5min，45.3%缓冲溶液A，54.7%缓冲溶液B，

        5.0min，36.3%缓冲溶液A，63.7%缓冲溶液B，

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物5μL。

7.根据权利要求4、5或6中任一项所述的食品和农副产品中蛔虫卵的PCR-DHPLC检测方法，其特征在于：所述的样品DNA由以下方法制备：向样品中加入4μL DNA抽提缓冲液和1μL浓度为10mg/mL的蛋白酶K，充分混匀后在55℃下消化3h；90℃，20min；加入0.4μL的20%Tween20，充分混匀。