[发明专利]一种猪肉中主要致病菌五重PCR快速检测方法

说明书

技术领域

本发明所属食品中致病菌快速检测技术领域，涉及一种五重PCR快速检测方法，具体涉及猪肉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特氏菌和小肠结肠炎耶尔森菌5种主要致病菌五重PCR快速检测方法。

背景技术

当前全球食品安全主要问题之一就是食源性疾病，其中食源性致病菌的污染是其重要因素之一。猪肉及产品营养丰富，在生猪饲养、屠宰加工、包装、贮藏、运输、销售等过程中极易感染或污染各种致病性微生物，进而引发肉品安全问题。为确保肉品安全，需要大力加强肉品检测的力度，尤其是肉中食源性致病菌的快速检测技术。可传统检测技术，检测时间长，检测程序繁琐，己无法满足肉品行业对于食源性致病菌快速检测的要求。近年来，随着PCR技术的发展，针对某一种或一类致病菌的PCR检验方法已被建立起来，但是食品污染哪一种致病菌是不确定的，且往往不止污染一种致病微生物，一旦检测的方向有误就会造成时间和药品的浪费或者漏检。因此，急需建立一种快速、有效且高通量的PCR检测方法。多重PCR（multiplex PCR）技术实现了对多种菌的同步检测，更加节省时间和成本，是快速检测食源性致病菌的重要研究方向。

多重PCR是指在同一个反应体系中，加入多对特异性引物，如果存在与各引物对特异性互补的模板，即可同时在一个反应管中扩增出一条以上的目的DNA片段，实现了一次性检测多种食源性致病菌的目的。目前，应用多重PCR对食品中常见致病菌进行检测已有较多报道，如二重（Blais BW,Phillippe LM.Food Control1995,4(6):211–214）、三重（Elizaquivel P,Aznar R.Food Microbiol2008,25:705-713）、四重（Koh SF,et al.Journal of Microbiological Methods2012,90:305–308），但是同时对食品中五种及以上食源性致病菌进行多重PCR检测报道较少。

猪肉营养丰富，易污染多种食源性致病菌，猪肉中常检出的食源性致病菌主要包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森氏菌及单增李斯特菌等（Mataragas M,et al.International Journal of Food Microbiology2008,126:1-12）。目前，针对猪肉中上述常见食源性致病菌进行多重PCR的研究中，但有关小肠结肠炎耶耳森菌的多重PCR尚无报道。小肠结肠炎耶尔森菌是重要的食品致病菌，很多国家都已将该菌列为进出口食品的常规检测项目。该菌广泛分布于猪、牛等家畜、家禽等，可以通过食品等途径传染给人，引起各种人畜共患性疾病。此外，已有研究证实，细菌16S rRNA基因作为内控基因可以验证所提取的DNA源自于食品中的细菌（Germini A,et al.Food Control2009,20:733-738）。然而，猪肉中食源性致病菌的五重以上PCR研究中，以细菌16S rRNA基因作为内控基因的研究未见报道。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足，以细菌16S rRNA基因作为内控基因，建立猪肉中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和小肠结肠炎耶尔森菌这五种食源性致病菌的多重PCR检测方法。为猪肉中致病菌的检测提供快速、灵敏度高、特异性强的多重PCR检测技术，为保障猪肉安全控制提供技术支撑。

本发明的具体步骤如下：

（1）提取待测肉样中总细菌DNA，

（2）合成SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.12所示的5种目标菌株的特异性靶基因和细菌16S rRNA内控基因所对应的引物；

（3）以步骤（1）的总细菌DNA为模板，加入步骤（2）的6对引物，进行五重PCR反应，PCR产用2%琼脂糖进行电泳分析，根据电泳结果判断待测肉样中是否含有沙门氏菌、单增李斯特氏菌、大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌和金黄色葡萄球菌。

本研究所选用的目的菌株的引物序列均参考国内外公开发表文献中报道的具有的致病性的特异性靶基因所对应核苷酸序列，并运用NCBI中的BLAST程序进行比对，选择最佳的引物用于试验研究。引物委托上海英骏生物技术有限公司（Invitrogen Company,China）合成。引物信息见表1。

2.细菌DNA提取