[发明专利]一种非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及到一种非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒。

背景技术

地中海贫血又称海洋性贫血，是遗传性溶血性贫血。其发病机制是合成血红蛋白的珠蛋白链减少或缺失导致血红蛋白结构异常。地中海贫血按照受累的氨基酸链来分类，通常将地中海贫血分为α、β、δβ和δ等4种类型，其中以β和α地中海贫血较为常见。

在国外，地中海贫血以地中海沿岸国家(故名为地中海贫血)及东南亚各国多见。我国长江以南的广大地域为地中海贫血高发区，其中尤以广西、广东和海南三省（区）为甚，其他如香港、台湾、福建、江西、云南、贵州、四川等省（区）也是发病较为严重的低区。广西α和β地中海贫血人群携带率高达24%，居全国之首，广东为11%居全国第二位。

α-地中海贫血是α-珠蛋白基因突变导致α-珠蛋白链合成缺陷所引起的一种遗传性溶血性贫血，简称α-地贫。血红蛋白四聚体的α-链合成量不足或失效，从而引起α链/非α链失衡，是导致溶血发生的直接原因。α-珠蛋白基因缺失或点突变均可导致α-地贫，分别称为缺失型或非缺失型α-地贫。

自1977年报道首例非缺失型α地中海贫血以来，目前至少发现了68种与非缺失型α地中海贫血有关的突变，其中17种位于α1基因，46种位于α2基因，其余5种位于α1、α2基因以外的地方。在中国，目前已报道了至少6种非缺失型α地中海贫血基因突变，其突变类型见表1，这些突变均位于α2-珠蛋白基因上，其中α^CSα/，α^QSα/，α^WSα/是最常见的3种突变。

表1

目前普遍应用的基因突变检测方法为限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）和DNA测序法，也有一些其他方法用于基因突变研究方法，这些方法的优点和不足点见表2。

表2

现有的非缺失型α地中海贫血基因检测相关的专利数目不在少数，其主要是利用基因芯片法或是PCR反向结合点杂交法。这两种方法的涉及的操作步骤多，无法在PCR后直接判读结果，都要对PCR产物进行后续的分析，开管操作容易发生污染，检测过程耗时较长。

而使用TaqMan探针荧光PCR法时，设计相对较难，尤其是TaqMan探针的设计，既要保证特异性又要满足有效和高效地扩增，同时需要解决单管多通道检测时通道间的信号干扰问题，以及之前荧光PCR仪器用户不多的问题等，都影响了TaqMan荧光PCR法的应用。

为了提高检测效率和准确性，开发一种用于非缺失型α地中海贫血的检测系统很有必要，此系统需具有操作简便、检测速度快、准确性高的特点。

发明内容

本发明提供一种用TaqMan探针荧光PCR法检测非缺失型α-地中海贫血的快速检测试剂盒，利用本试剂盒可以同时检测两种非缺失型α-地中海贫血，该试剂盒可高通量操作，操作简单快捷，结果判读直观。

本发明的技术方案为提供一种非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括两个PCR反应试剂，其为：PCR反应试剂Ⅰ和PCR反应试剂Ⅱ，所述PCR反应试剂包括引物、探针、PCR Buffer、dNTPs、MgCl₂、DNA聚合酶、UNG酶、甜菜碱；

所述PCR反应液Ⅰ包括扩增非缺失型α地中海贫血基因QS突变型和野生型的两个位点的一对引物和两条探针，其为：上游引物F：SEQ ID No.5，下游引物R为序列SEQ ID No.6；QS野生型探针QSN：SEQ ID No.1，QS突变型探针QSM：SEQ ID No.2；

所述PCR反应液Ⅱ包括扩增非缺失型α地中海贫血基因CS突变型和野生型的两个位点的一对引物和两条探针，其为：上游引物F：SEQ ID No.5，下游引物R：SEQ ID No.6；CS野生型探针CSN：SEQ ID No.3，CS突变型探针CSM：SEQ ID No.4。

优选的，上述的非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒中，所述探针QSN的5’端标记FAM，3’端标记MGB，所述探针QSM的5’端标记VIC，3’端标记MGB；所述探针CSN的5’端标记FAM，3’端标记MGB，所述探针CSM的5’端标记VIC，3’端标记MGB。

优选的，上述的非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒中，所述的PCR反应试剂Ⅰ各组分含量为：

10x PCR Buffer：4μL；