[发明专利]一种检测间充质干细胞分布的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测间充质干细胞分布的方法，用于对外源性间充质干细胞在体内的存活、分布情况的研究。

背景技术

间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，可以从成年个体的骨髓、脂肪、皮肤等组织中获得，具有自我更新和多向分化能力，在体内外特定的条件下能够分化成为神经细胞，心肌细胞，成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞等各种不同功能的细胞。研究表明间充质干细胞移植在临床应用中有着广阔的前景，特别能对不具有再生能力的组织损伤进行修复，对心肌梗死、创伤性脑损伤、糖尿病、肺损伤、肝损伤、癌症可能具有重要的治疗意义。

要研究间充质干细胞移植的治疗效果，首先就要了解其在体内分布的规律，例如系统性给予间充质干细胞治疗后其在各个脏器的分布，局部给予间充质干细胞后的分布，在某些病理变化时对间充质干细胞分布的影响，这些数据是开展间充质干细胞治疗研究的基础。

现有技术中，用于跟踪移植后间充质干细胞在体内分布的方法主要有以下两种：

荧光蛋白标记法。荧光蛋白标记技术是利用基因载体将荧光蛋白基因导入待标记细胞，通过筛选获得表达荧光蛋白的细胞，可通过荧光显微镜直接观察，而不需反应底物。荧光蛋白为可自发产生荧光的蛋白质，主要包括绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)和其衍生物黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)、蓝色荧光蛋白(bluefluorescent protein，BFP)，以及红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)。YFP，BFP 为GFP的突变体，荧光强度比野生型GFP高。绿色荧光蛋白基因具有高效、稳定、无毒、易于检测等特性，能在活细胞中直观地观察其表达，可较快筛选其修饰的细胞。这种技术主要的短处在于：需要转基因动物，价格较高；很多脏器组织带有自发荧光成分，会干扰结果的观察；只能在切片局部估计细胞的分布，很难在整体水平上定量细胞的分布。

荧光染料标记法。在分离细胞后，用一些亲细胞的荧光活性染料染色细胞，再注射给动物，通过组织学方法观察染料的荧光，可以反映出细胞在体内的分布。这种技术主要的短处在于：染色的效率不可能达到100%；染色会影响间充质干细胞的功能；细胞的染色随着时间的延长而丢失；染色细胞在分裂过程中染料会相应分离到子代细胞中，导致荧光稀释；脏器组织自发荧光的干扰；难以在整体水平上定量细胞的分布。

所以需要开发更精确的检测间充质干细胞分布的方法。

发明内容

本发明涉的目的是提供一种简单、精确的检测间充质干细胞分布的方法。

本发明的原理是以雄性动物作为供体，以雌性动物作为受体，进行间充质干细胞移植，通过PCR技术扩增雄性细胞特异性的性别决定基因（SRY基因）中的片段，根据PCR产物的多少来测定雌性动物体内间充质干细胞的分布。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测间充质干细胞分布的方法，包括如下步骤：

（1） 将提取后的雄性动物间充质干细胞移植至雌性动物体内；

（2） 细胞移植后提取组织基因组DNA并进行定量：将样本在组织消化液中45～55℃消化0.5～20小时；然后将消化液加入到同体积的氯仿中，震荡，静置5～10分钟后离心分离，取上层液加入到同体积的异丙醇中，震荡，静置5～7分钟后离心分离，弃上清，用75%的乙醇溶液洗涤沉淀；用紫外光分光光度计在260 nm处对洗涤后的沉淀进行DNA定量； 

（3） 聚合酶链反应及鉴定：以血红蛋白β亚单位基因为内参基因，SRY基因为目的基因，分别设定引物，然后进行定量聚合酶链式反应扩增；通过PCR产物的定量分析可以检测间充质干细胞在雌性动物体内的分布。

上述技术方案中，所述雄性动物间充质干细胞来源于骨髓、脂肪或者皮肤组织；优选为骨髓组织。

上述技术方案中，组织消化液包括三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl） 100 mmol/L pH 8.0，NaCl 200 mmol/L，乙二胺四乙酸（EDTA） 5 mmol/L，十二烷基硫酸钠（SDS） 2mg/ml，蛋白酶K 0.1mg/ml。

上述技术方案中，离心分离时的离心力为12000xg；时间为10min。