[发明专利]鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的分子标记方法以及试剂盒和引物

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及鉴定青花菜杂交种‘海绿’真实性和或品种纯度的分子标记方法以及试剂盒和引物。

背景技术

优良品种是作物高产的基础，品种混杂和纯度不高则会明显降低产量和商品品质。快速准确地鉴定品种和进行纯度分析对于种子质量标准化、品种审定、假种辨别、产权纠纷均有重要作用。目前，我国种子生产和经营管理还不太规范，不合格的种子屡屡混入市场并用于生产，造成减产和经济损失，因此品种纯度鉴定显得尤为重要（吴敏生，王守才，戴景瑞，DNA指纹图谱技术在品种鉴定和纯度分析上的应用[J]. 农业生物技术学报，1998，6（1）：51-56；王忠华. DNA指纹图谱技术及其在作物品种资源中的应用[J]. 分子植物育种，2006，4（3）：425-430.）。

目前生产中，青花菜杂交种通过自交不亲和系或雄性不育系制种。利用母本的自交不亲和性制种，由于自交不亲和性受环境因素影响会有少量自交种产生从而影响杂交种纯度。如不及时有效鉴定杂交种纯度，则会给青花菜生产带来严重损失。因此，对青花菜杂交种进行快速、准确而高效的纯度鉴定，对青花菜杂交种的推广应用具有重要的现实意义。传统的品种纯度检测方法有多种：幼苗鉴定、蛋白质电泳方法以及田间小区种植鉴定等（潘显政.农作物种子检验员学习读本［M］.北京：中国工商出版社.2006：239～245.）。这些检测方法费时费力且不够直观。以DNA为基础的分子标记技术如简单重复序列（SSR）等，具有检测位点数量多，多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，已在青花菜品种鉴定、种子纯度检测和品种亲缘关系及分类等方面得到应用，并发挥着越来越重要的作用。

‘海绿’是由宁波海通食品科技有限公司、浙江省农业科学院蔬菜研究所等多家单位联合选育的国产优质青花菜杂交种，该品种的两个亲本均为通过小孢子培养技术获得的具有自主知识产权的DH系。2012年12月通过浙江省非主要农作物品种审定委员会审定（浙（非）审蔬2012010）。‘海绿’是通过小孢子培养技术获得的具有自产知识产权的两个DH系亲本杂交而成的优质品种。为保证该优良品种产生最大的经济效益，需要一种权威、准确、稳定检测方法对其商品种子的真伪及其纯度进行快速鉴定。

发明内容

针对目前青花菜品种种子纯度鉴定大多依靠田间表现型观察方法所存在的鉴定时间长、受季节性限制及作物的表现型易随环境条件变化等缺陷，本发明的一个目的是提供鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的引物，本发明的二个目的是提供鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的试剂盒，本发明的三个目的是提供鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的分子标记鉴定方法，本发明的方法能早期、全年、快速、准确鉴定青花菜品种纯度和或品种真伪。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的引物，该引物为以下的4对引物中的1对或多对组合：

1）引物Ol12-D05：上游引物的序列为5’-TCCATGACCAACGACAAGGTC-3’，下游引物的序列为5’-AAGAGGCGACTTCTATTGCG-3’；

2）引物Ra1-F06：上游引物的序列为5’-ACCAAAATGTGTGAAGCCAC-3’，下游引物的序列为5’-CTTGTGGCCAGATTCATCAC-3’；

3）引物FITO439：上游引物的序列为5’-CGAGAAGAGATAGCGGGT-3’，下游引物的序列为5’-AGGTTGTGACTCCATCAAAG-3’；

4）引物Ol10-A11：上游引物的序列为5’-CACAATTTCTCAGACAAAACGG-3’；下游引物的序列为5’-GAGCTGGCTCATTCAACTCC-3’。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的试剂盒，该试剂盒包括：上述技术方案所述的引物；dNTP；Mg²⁺；PCR缓冲液；Taq DNA聚合酶。

作为优选，所述的试剂盒还可以包括染色液和显色液，染色液为AgNO₃溶液，显色液为NaOH、硼砂和甲醛的混合溶液。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的分子标记鉴定方法，该方法包括如下步骤：

1）提取青花菜基因组DNA；