[发明专利]一种双孔多糖微球及其制备方法、用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种微球及其制备方法、用途，尤其涉及一种双孔多糖微球及其制备方法、用途。

背景技术

随着生命科学的发展，与之相关的生物大分子的分离已成为极其重要的课题。目前，大规模制备蛋白的分离纯化技术已经成为生物技术发展的一个限制因素，国内外正在进行大量的研究，这个方向也成为科技投资的重点之一。

虽然生物分离介质的研究已经有几十年的历史，介质的性能（如机械强度、适用范围和使用寿命）及其分离能力都有很大提高，但分辨率、容量和分离速度这三个因素还是难于协调。尤其对生物大分子来说，由于其体积大、结构易变，对分离条件的要求更高。然而，常规的多糖分离介质其自身孔径较小，如分离中常用的琼脂糖介质，其自身孔径在2-50nm左右。由于孔径较小，流动相在孔道内的传质过程主要依靠分子扩散完成，导致生物大分子的传质速度慢、分离时间长。

为克服上述不足，急需开发新的方法来制备具有大孔径（大于10或20倍的生物大分子的直径）的新型分离介质。例如，Afeyan等人（参见US 5019270，US 5228989，US 5833861）制备了以苯乙烯为基质的大孔聚合物微球，其具有两类孔，一类是的贯穿孔（through pores），一类是的扩散孔（diffusion pores）。贯穿孔内流体可以以对流形式流动，传质速度快；而扩散孔提供了足够高的比表面积，保证了介质的吸附容量；另外，贯穿孔与扩散孔之间的距离短，流动相很容易扩散入内。然而以苯乙烯为基质的聚合物微球其疏水性较强，用于分离生物大分子时必须经过亲水镀层修饰，其工艺繁琐且存在着镀层脱落的问题，这在一定程度上制约了它的应用。因此开发大孔多糖微球成为了研究的重点，目前文献报道有以下几种方法。

(1)复乳法

Gustavsson和Larsson等（参见P.E.Gustavsson,P.O.Larsson.Superporous agarose,a new material for chromatography.Journal of Chromatography A.1996,734:231-240；US 5723601）报道了用油相（环己烷）作为液体致孔剂，采用油包水包油复乳法制备大孔琼脂糖微球的方法。这类大孔琼脂糖微球既具有琼脂糖自身的凝胶孔（2-50nm），同时还具有较大的流通孔（50-1000μm），可以极大地提高操作流速。然而该微球中流通孔孔径难以控制，并且由于使用了有机溶剂作为液体致孔剂，微球中会残留较多的有机溶剂，难以完全清除，给后续分离带来一定的影响。

(2)无机颗粒致孔

孙彦等（参见Q.H.Shi,X.Zhou,Y.Sun.A novel superporous agarose medium for high-speed protein chromatography,Biotechnology and Bioengineering.2005,92(5):643-651；CN 1194811C）用碳酸钙颗粒（粒径范围0.86-4.58μm）作为固体致孔剂制备出大孔琼脂糖微球。然而，由于在制备过程中需要用到稀盐酸除去碳酸钙颗粒，在去除过程中将产生大量的气泡，凝胶介质的流通孔中由于大量气泡的快速产生形成的压强远远大于凝胶介质外界的压强，如此形成的凝胶介质的高的内外压差会对大孔琼脂糖凝胶介质的机械强度产生很大的负面影响。CN 100478066C公开了一种大孔琼脂糖凝胶介质的制备方法，将碳酸钙颗粒替换为金属氧化物颗粒作为固体致孔剂，避免了去除致孔剂时气泡的产生。然而，其制备过程同样需要用到稀酸去除固体致孔剂，造成制备过程繁琐，致孔剂难以完全清除。并且所使用的稀酸还会对环境造成一定的影响。

上述的技术制备过程繁琐，需要后续工艺除去致孔剂，致孔剂难以完全清除，可控性差。此外，这些方法制备出的多糖微球的粒径分布宽，在实际应用时需要筛分，并且筛分后的微球仍具有较宽的粒径分布。而对于分离纯化应用而言，微球介质的粒径和均一度对分离结果具有重要影响。此外，其它一些用于制备大孔材料的方法，如反复熔融、冷冻-干燥等，由于反复熔融以及冷冻-干燥的过程会对微球的形态产生很大影响，使微球发生变形、聚集，甚至出现碎球等，因此一般不用于制备大孔微球介质。

发明内容