[发明专利]一种检测狗钩端螺旋体核酸的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及致病性狗钩端螺旋体诊断的荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒。此发明敏感、特异、快速的扩增感染狗的致病性钩端螺旋体（Leptospira interrogans Canicola Canicola,L.interrogans Icterohemorrhagiae Icterohemorrhagiae,L.interrogans Pomona Pomona,和L.kerschneri Grippotyphosa Grippotyphosa），而不扩增非致病性的钩端螺旋体（L.biflexa）的核酸。

背景技术

钩端螺旋体能引起多种动物和人发病的重要人畜共患病。钩端螺旋体感染的主要现有实验室诊断技术包括：1）临症诊断。钩端螺旋体引起的临症症状不特异,在临床诊断的价值有限；2）病原体分离:此发需要的时间长,而且需要经过特殊训练的专业人才;3)血清学实验检测抗钩端螺旋体的抗体。此技术的局限性是不能对钩端螺旋体进行早期诊断,而且不能有效区别诊断区分钩端螺旋体的感染者、感染后的康复者和接受了疫苗接种者；3）PCR技术检测钩端螺旋体的核酸。钩端螺旋体现有16个种、约38个血清组、超过250个血清型，感染多种宿主。此外，钩端螺旋体的基因的流动性很大，不同株之间的基因序列差异较大。因此，很难有一个单一的PCR方法精确、敏感、快速的检测所有株的钩端螺旋体。现有的PCR方法不能对狗的钩端螺旋体感染起到快速、有效的分子诊断。尤其重要的是，钩端螺旋体的患者的血液、尿液中的钩端螺旋体的数量低，而现在市场上的诊断技术的灵敏度不够。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、特异性强、灵敏度高、适合临床使用的检测的感染狗的致病性钩端螺旋体的定量PCR检测技术，包括检测引物、探针和试剂盒。

本发明的原理和最核心的技术关键是科学地设计扩增和检测狗致病性钩端螺旋体的特异、高效的引物和探针。在保证设计的引物高效扩增致病性狗钩端螺旋体、设计的探针特异检测致病性狗钩端螺旋体的同时，确保此引物和探针不扩增和检测非致病性的钩端螺旋体。从GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）获取如下致病性狗钩端螺旋体的LigA基因序列，并用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法对所有序列进行对齐。相关的信息见表-1：

表-1.致病性狗钩端螺旋体。

图-1显示本发明设计的引物和探针如下：

上游引物：5’-GCTACWGGGATCTACTCTGACAACTC-3’（SEQ ID NO.1）;

下游引物：5’-GGACTACTTACYTTTCCGAATGTGGCT-3’（SEQ ID NO.2）

6-FAM探针:5’-ATTTCAAACGCCMAAAAAAATCAAGGAAACKCTTA-(6-FAM)-3’（SEQ ID NO.3）;

LCRed640探针：5‘-(LCRed640)-GGAGCAGCTACAGGARCAACGGATATT-(磷酸建)-3’（SEQ ID NO.4）。

本发明还公开了检测狗钩端螺旋体核酸的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括5x FRET-qPCR Stock22微升,以及22微升的5x的Oligo混合物（含浓度为5μM的上游引物、5μM下游引物、1μM的6-FAM探针、1μM的LCRed640探针）。

本发明的技术方案是通过以下实验得出：

（1）致病性狗钩端螺旋体的定量PCR特异性的确定：

i)设计的引物用于GenBank的BLAST搜索，确认本发明设计的引物特异地扩增致病性狗钩端螺旋体的核酸，而不扩增其它病原体和非致病性钩端螺旋体的核酸。用176-bp的PCR产物进行BLAST的结果显示，致病性钩端螺旋体的序列和PCR产物有98-100%的吻合。除此之外，最高吻合度的是和非致病性钩端螺旋体的6%相似性；

ii）由Integrated DNA Technology公司合成致病性狗钩端螺旋体标准株的、涵盖PCR的扩增区域的序列。用设计的PCR系统（上游引物，下游引物，6-FAM探针，LCRed640探针）对合成的钩端螺旋体DNA进行PCR扩增；

iii）对阳性样品（Leptospira interrogans Pomona）进行PCR扩增；

iv）对阴性对照和其它类似病原体的核酸进行PCR扩增；