[发明专利]一种改良的高灵敏高效的检测和鉴定转基因小麦的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高灵敏高效的检测转基因小麦染色体的方法，本发明还涉及一个快速高效的获取形态良好的中期分裂相的植物染色体的方法，属于细胞生物学和分子生物学研究领域。 

背景技术

小麦是世界上重要的粮食作物之一，与社会经济发展、粮食安全供给和人类营养健康密切相关。遗传基础狭窄已经成为制约作物品种单产水平、抗性、适应性等重要农艺性状进一步提升的关键因素(叶兴国et al.2011)。基因工程育种作为杂交育种的主要补充手段，已经在大豆、玉米、棉花和油菜等作物中取得了巨大成功，基因工程赋予了这些作物本身所不具备的抗除草剂、抗虫等一些优良的性状。在国家“863”计划和“转基因植物研究与产业化专项”等科技项目的资助下，我国转基因小麦研究尤其理论上取得了很大进展。随着分子生物学和植物基因工程的不断发展，越来越多的育种工作者开始利用转基因技术获得常规育种技术难以得到的新种质和新品种。 

检测转基因是否发生目前常用的方法主要有：PCR法，Southern杂交和荧光原位杂交(FISH)。PCR可以检测目的基因是否整合在受体细胞的染色体上，PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。同时对多位点插入难以检测。检测外源基因整合在植物染色体上最可靠的方法就是Southern杂交和原位杂交。Southern杂交可检测外源基因插入的拷贝数和插入方式，是一种较为精确的分析，Southern法准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。另外，由于Southern法检测不经过靶片段的扩增(PCR)，一般每个电泳通道需要10-30μg的DNA，在实际操作中 就需要较大量的植物材料来提取DNA，而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。如果外源基因在插入时发生基因重组，造成限制性酶切位点丢失，Southern法也无法检测到。这些因素都制约了Southern法在T0代转基因植物中检测外源基因拷贝数的应用。 

荧光原位杂交(FISH)是20世纪生物学领域的一项新技术，是一项利用标记的DNA探针直接在染色体、间期核和DNA纤维上定位特定靶DNA序列的技术，具有较高的敏感性和特异性，已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段，广泛应用于植物学各方面的研究，例如植物基因的染色体物理作图(Miller et al.1983；Mukai et al.1990)，杂种中亲本染色体的鉴定，外源染色体或染色体片段的检测(Schwarzacher et al.1989)，物种进化及亲缘关系的探讨(Mukai et al.1993)，转基因材料中外源基因的定位(Kenton et al.1995)等。尤其在检测转入基因及其表达产物方面有着明显的优势，它不仅能检测外源基因是否存在而且还能将外源基因直接定位在染色体的相应位置，但由于转化基因一般为小的单拷贝序列，所以对于转基因植株的FISH分析技术要求较高，难度最大。需要优良的染色体制片和高灵敏度的FISH操作程序(Harwood et al.2004)。 

在植物FISH实验中，传统方法是取分裂旺盛的植物根尖，采用低温处理或化学药剂进行预处理，使染色体适当凝缩、分散，然后进行压片，压片法是植物染色体制片的最常用的方法，也就是将经过预处理的材料在卡诺固定液中固定后，用HCl或维素酶与果胶酶混合液解离，除去部分细胞壁和细胞质，然后用45％的醋酸压片，液氮冷冻揭去盖玻片，但这种方法成功率较低，主要是因为压片力度不好掌握，染色体很难完全散开，容易产生重叠、变形、断裂等，此外未去除干净的细胞质及细胞壁对染色体的覆盖，使原位杂交的信噪比增高。同时在揭片时可能由于玻片清洁度的原因，很容易将染色体揭掉，整个过程费时费力，且技术难度较大，很难获得良好的染色体制片。由于其染色质凝缩程度很高，细胞质较厚，一般情况下分辨率为5-10Mb(Pedersen and Linde-Laursen 1995)，灵敏度为10kb左右，对于大多数实验室而言小于10kb的基因检出率很低(荣红颖et al.2007)。金危危等(金危危et al.2001)利用减数分裂中期染色体制片对转入 水稻的大约4.8kb的外源基因进行了定位，检出率为11.7-30.4％。植物减数分裂粗线期染色体的凝缩程度比中期染色体的低得多，其长度比相应的中期染色体大7～50倍，使探针DNA容易进入，因而检测灵敏度也有所提高。不过，选择时期合适的用于制备粗线期染色体的花粉母细胞是很困难的，并且粗线期染色体很长，难以追溯和识别单个的染色体这些不利因素限制了粗线期FISH的应用。