[发明专利]实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属检测领域，涉及核酸检测方法，具体涉及一种实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法。 

背景技术

现有技术公开了手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是由人肠道病毒(human enterovirus，HEV)引起的常见传染病；有统计显示，该病一年四季均可发病，5～7月为高发期，5岁以下儿童多见，其中的大多数临床症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主，少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹（AFP）、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。自1997年至今，在马来西亚，新加坡，澳大利亚，中国等多个国家已经有数次HFMD暴发流行；HFMD已经成为亚太地区严重的公共卫生问题并引起多个国家的关注。尽管引起HFMD的主要病原是EV71和CA16，但是近年来多个国家报道了以CA6为主要病原导致的HFMD暴发流行；2008年秋冬季，芬兰报道了以脱甲病为主要临床表现的HFMD的暴发，主要病原是CA6；同样，从2009至2011年在台湾，日本和新加坡等地区相继暴发了以CA6为主要病原的HFMD。在2012年冬季中国上海地区对肠道病毒监测中，发现了CA6取代了EV71为导致HFMD的主要肠道病毒。上述统计结果表明，CA6有可能成为新发的HFMD暴发流行的主要病原，因此，在HFMD的防控工作中，对于CA6的日常监测显得非常必要。 

传统的HEV鉴定分型主要基于病毒分离和抗血清中和实验；但该方法鉴定周期长且抗血清容易和其他HEV产生交叉反应，随着分子生物学的发展，基于病毒核苷酸序列分析的分型方法越来越多地被应用。Nix等人研究的snPCR方法，结合sanger测序的方法可快速灵敏用于HEV分型鉴定。上述分子分型方法虽可对HEV分型鉴定，但通常需要测序和序列比对来确定病原，尤其在HEV暴发流行时，所述方法往往不适用于临床大规模标本中病原检测。迄今为止，世界范围内已经有数次CA6导致的HFMD暴发，但用于CA6特异性检测快速灵敏的方法尚鲜见有报道，尤其是未见有关特异性实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测CA6病毒的方法的报道。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供用于CA6特异性检测快速灵敏的方法，具体涉及一种实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法。 

本发明方法基于CA6 VP1序列设计了特异性的引物和Taqman探针，可用于快速、特异和高灵敏度地检测疑似患者标本，进一步为HFMD的临床诊断和治疗及疫情防控提供参考依据。 

具体的，本发明的实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法，其特征在于，其包括步骤： 

（1）临床采集标本

收集手足口病患者的咽拭子、粪便标本；

（2）设计引物

根据Genbank库中收录的CA6的衣壳蛋白（VP1）编码序列并结合CA6流行地区的VP1序列，本发明的实施例中采用上海地区CA6流行的VP1序列，采用Primer Express 3.0设计合成CA6特异性real-time PCR的引物和探针；采用NCBI网站上的BLAST工具盒BioEdit软件（version 7.0.9）分析所设计的引物和探针的保守性；

所述引物和探针由上海Invitrogen公司合成；

（3）提取核酸，Real-time PCR和T-A克隆

采用High Pure Viral Nucleic Acid Kit（Roche 11858874001）提取病毒基因组RNA；将样本加入含poly(A)的Binding Buffer中，再加入蛋白酶K混匀，72 ℃裂解10 min，用柱子吸附RNA，加入Inhibitor Removal Buffer洗1次；再用Wash Buffer洗2次，最后用50 μl Elution Buffer洗脱RNA；

PCR采用试剂盒（Takara DRR064A）进行，反应液中包含2× Buffer Mix 12.5μl, TaKaRa Ex Taq HS（5 U/ μl）0.5μl, PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μl, 上游引物CA6F 10pmol,下游引物CA6R 10pmol，探针3pmol,RNA模板2.5μl；