[发明专利]实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法

权利要求书

1.一种实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法，其特征在于，其包括步骤：

（1）采集标本

收集手足口病患者的咽拭子、粪便标本；

（2）设计引物

根据Genbank库中收录的CA6的衣壳蛋白VP1编码序列并结合CA6流行地区的VP1序列，设计合成CA6特异性real-time PCR的引物和探针，然后分析上述述引物和探针的保守性；

（3）提取核酸，Real-time PCR和T-A克隆

提取病毒基因组RNA；将样本加入含poly(A)的Binding Buffer中，再加入蛋白酶K混匀，72 ℃裂解，用柱子吸附RNA，加入Inhibitor Removal Buffer洗1次；再用Wash Buffer洗2次，最后用Elution Buffer洗脱RNA；

PCR采用试剂盒（Takara DRR064A）进行，25μl反应液中包含2× Buffer Mix 12.5μl, TaKaRa Ex Taq HS（5 U/ μl）0.5μl, PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μl, 上游引物CA6F 10pmol,下游引物CA6R 10pmol，探针3pmol,RNA模板2.5μl；

其中，PCR反应条件：42℃反转录，10min；95℃10s，60℃40s，运行45个循环，在60℃进行荧光采集；反应在实时荧光定量PCR仪上进行，引物和探针序列为，

*参考的CA6病毒株为TW/399/10（Genbank No. JQ946054）；

取Real-time RT-PCR阳性产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳；采用割胶纯化试剂盒回收107bp 大小的PCR产物，通过T-A克隆试剂盒将PCR产物克隆进pMD18-T载体；通过测序获得克隆片段序列，然后用BLAST工具对克隆片段进行比对分析；

（4）评估Real-time RT-PCR的灵敏度和特异性

采用T-A克隆质粒制作标准品进行Standard curve实验的方法：首先微量紫外分光光度计对克隆质粒进行核酸定量，然后进行10倍模板稀释，制作10⁷～10²copies/μl的标准品；以所述标准品为模板进行Real-time RT-PCR，获得Standard curve；

选取18种HEV血清型，包括EV71，EV68，CVA2，CVA4，CVA5，CVA10，CVA12，CVA21，CVB1，CVB2，CVB4，CVB5，Echo 3, Echo 9, Echo 19, Echo 25, Echo 30验证该PCR方法的特异性：首先采用High Pure Viral Nucleic Acid Kit提取上述病毒株的基因组RNA，再以上述基因组RNA为模板并选择克隆质粒为阳性对照品进行real-time RT-PCR，观察扩增曲线；

（5）Real-time RT-PCR检测临床标本 

对采集的标本，进行核酸提取；然后采用RT-PCR进行肠道病毒属特异性筛选；筛选出的肠道病毒阳性标本再采用RT-PCR的方法进行EV71和CA16的筛选；肠道病毒属检测阳性而EV71和CA16检测阴性的标本，采用Real-time RT-PCR方法检测CA6，同时，采用RT-snPCR方法对上述标本进行平行检测分型，验证新荧光定量PCR方法的准确性。

2.按权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，采用Primer Express 3.0设计合成CA6特异性real-time PCR的引物和探针；采用NCBI网站上的BLAST工具盒BioEdit软件分析上述引物和探针的保守性。

3.按权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，采用High Pure Viral Nucleic Acid Kit Roche 11858874001 提取病毒基因组RNA。

4.按权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，PCR采用试剂盒Takara DRR064A 进行；实时荧光定量PCR仪为Applied Biosystems, ViiA 7系统。