[发明专利]Line-1基因甲基化定量检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种Line-1基因甲基化定量检测方法。

背景技术

在肿瘤细胞增殖与分化中，基因突变、DNA甲基化紊乱表达、LOH缺失等是导致癌基因和抑癌基因调控紊乱的主要原因，而DNA甲基化作为非常重要的表观遗传机制，均参与上述调控过程，在肿瘤的形成中发挥潜在作用。

基因异常DNA甲基化的检测方法主要有甲基化敏感性限制性内切酶法、重亚硫酸盐测序法（BSP）以及甲基化特异性PCR法（MSP）三种。

其中甲基化特异性PCR法是目前研究基因甲基化最为广泛的、首选的方法。但是该方法仍然存在下列缺点：（1）这种方法只能作定性研究，即只能明确是否存在甲基化；若要求定量．则需用其他的方法进行进一步检测；（2）若要区分甲基化引物与非甲基化引物扩增产物量的不同，需要严格控制PCR反应的条件及循环数。而甲基化特异性PCR法最为关键的一点在于引物的设计。

Line-1基因是一种分布在人类基因组内的内源性的易变基因序列。研究表明，大约有4×10⁵的Line-1基因重复拷贝存在于人类基因组，它们占据整个人类基因组的5%。

在哺乳动物的基因组中，Line-1的反转录活性具有潜在的危险性，而Line-1基因启动子区的CpG岛DNA甲基化可导致其沉默，是一种重要的保护机制。DNA重复序列Line-1的甲基化有利于整个基因组的稳定性和完整性，而Line-1的低甲基化（去甲基化）却增加了基因组的不稳定性和有丝分裂重组的机会。Line-1序列启动子区的低甲基化可导致整个基因组的不稳定。低甲基化导致的Line-1反转录活性激活能够使肿瘤抑制基因失活（例如结肠癌中的APC），插入癌基因上游的Line-1启动子序列可以导致这些肿瘤基因的失活（例如乳腺癌中的c-myc基因）。

Line-1序列的低甲基化现象出现在多种肿瘤中，包括结肠癌、膀胱上皮癌、恶性生殖细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、神经内分泌肿瘤、前列腺癌、慢性髓样白血病等等。在一项研究中，作者用焦磷酸测序的方法检测了48例非细胞肺癌中Line-1序列的甲基化状态，结果发现Line-1的低甲基化水平与基因组的不稳定性相关。而在前列腺癌中，Line-1的低甲基化与肿瘤的恶性程度相关。因此，DNA重复序列的Line-1甲基化检测可作为肿瘤基因组整体低甲基化的标记物，研究Line-1序列的甲基化有助于我们对肿瘤发病机理的分子研究。

目前尚未发现检测Line-1基因甲基化的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Line-1基因甲基化定量检测方法。

实现本发明目的的技术方案是：一种Line-1基因甲基化定量检测方法，具有如下步骤：①对待测样本进行处理，得到样本模板；②设计并合成Line-1基因甲基化引物和Line-1基因未甲基化引物；③分别用步骤②的甲基化引物和未甲基化引物对步骤①的样本模板进行PCR扩增反应，并分别得到相应的PCR扩增产物；④对分别对步骤③得到的PCR扩增产物进行处理，并分别得到相应的标准品模板；⑤分别对步骤①的样本模板以及步骤④的标准品模板进行实时荧光定量PCR检测，并计算出甲基化程度。

其中步骤②中所述的Line-1基因甲基化引物如下：Line-1基因甲基化正向引物：CGCGAGTCGAAGTAGGGC；Line-1基因甲基化反向引物：ACCCGATTTTCCAAATACGACCG；扩增片段长度为110bp。步骤②中所述的Line-1基因未甲基化引物如下：Line-1基因未甲基化正向引物：TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT；Line-1基因未甲基化反向引物：ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA；扩增片段长度为110bp。

上述步骤①中所述的对待测样本进行处理包括：A、从待测样本中提取DNA；B、对提取的DNA进行亚硫酸氢钠修饰；C、对修饰后的DNA进行纯化，得到样本模板。

所述的待测样本包括组织、血液、体液、分泌物或者穿刺物。

上述步骤③中所述的PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环。

上述步骤③中所述的PCR扩增反应的反应体系为：

2.5μL不含MgC1₂的10xPCR buffer；

2.0μL浓度为25mM的MgC1₂；

2.0μL浓度为2.5mM的dNTP；

0.5μL浓度为5IU/μL的Taq酶；