[发明专利]一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用

说明书

本发明专利申请是申请号为“201010270772.9”的分案申请，原申请的申请日为“2010年8月31日”，申请号为“201010270772.9”，发明名称为“一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用”。

技术领域

本发明涉及发酵技术领域，具体涉及一种蛭弧菌制剂及其发酵方法与应用。

背景技术

目前控制、消除致病菌的主要手段仍是各种物理和/或化学的方法，包括各种抗生素的使用。物理和/或化学的方法都存在着明显的弊端，首先，抗生素大量滥用，会导致一些副作用的产生，如病原菌的抗药性、抑制有益菌群等。其次，酸碱处理的方法虽可达到一定的灭菌/杀菌效果，但在有害菌形成生物膜后，这些方法的效果就极不理想。最后，物理的方法对各种致病菌的消除作用只能应用于相关领域的某一环节，而难以扩展到整个领域的所有环节。生物防治的方法则可具有强大的优越性，极有可能使其服务于日常生活的病害防治以及生物战和恐怖袭击中大规模的水源性、食源性污染的处理等。

近年来微生物生态制剂的研究开发受到各方关注，特别是蛭弧菌的研究受到人们的青睐。蛭弧菌自1963年被发现以来，因其是一种寄生菌，能裂解大肠杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌、弧菌等革兰氏阴性致病菌且对人和动物无害，而备受关注。

将蛭弧菌应用于防治致病菌的关键是获得浓度高、裂解能力强的蛭弧菌制剂。为此，人们对蛭弧菌制剂的制备方法进行了不懈的研究，譬如专利申请号为93111749.6、名称为“生物制菌王及其生产方法”的国家发明专利申请提出用高温（70～150℃）或化学药物（氯仿等）将大肠杆菌杀死，制造灭活的宿主菌，接着用其培养蛭弧菌，得到蛭弧菌制剂；专利申请号200810145709.5、名称为“蛭弧菌微生态制剂的生产方法”提供了蛭弧菌微生态制剂的生产方法，主要和传统方法不同的是将宿主大肠杆菌冻干成菌粉使用。上述两份专利申请都采用活的大肠杆菌作为宿主菌，最终会影响生态环境。而本发明所用的宿主菌均为有益菌或是对环境无害的菌，不会对环境构成威胁。专利申请号200810202809.7、名称为“双效蛭弧菌的发酵生产方法”的国家发明专利申请提供了一种双效蛭弧菌的发酵生产方法，即先发酵制备宿主菌的混悬液，再加入宿主菌混悬液和蛭弧菌液到配制好的培养液中进行发酵。虽然该生产方法生产出的蛭弧菌含量较高（5×10⁸pfu/mL），但是其宿主菌选用了致病性的嗜水气单胞菌，而且发酵时间较长（72～120h），会导致其生产成本的增加。另外，此技术也可能存在着所得的蛭弧菌裂解活性不高的问题。而本发明采用的是革兰氏阳性菌为宿主，实验证明，以此宿主发酵制得的蛭弧菌能够维持，甚至提高对其他革兰氏阴性菌和阳性菌的裂解能力。

发明内容

为了克服现有方法所制备的蛭弧菌制剂含量低以及裂解活性低的问题，本发明的首要目的在于提供一种蛭弧菌制剂的发酵方法。

本发明的另一目的在于提供一种由上述发酵方法制备得到的蛭弧菌制剂。

本发明的再一目的在于提供上述蛭弧菌制剂的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种蛭弧菌制剂的发酵方法，包括以下步骤：

（1）宿主菌悬液的制备

将宿主菌培养至对数生长期，收集菌体，接着用磷酸盐缓冲液调整浓度，得到浓度为10¹⁷～10²²cfu/mL的宿主菌悬浮液，然后置于2～15℃中保存备用；

（2）蛭弧菌游泳体浓缩液的制备：

在磷酸盐缓冲液中加入步骤（1）制备的宿主菌悬浮液，调整宿主菌的浓度为10¹⁰～10¹⁵cfu/mL，再接入蛭弧菌斑，然后将此培养液在20～40℃培养20～60h，再在2～15℃，5000～8000rpm离心15～35min，保留上清液弃去沉淀，然后将上清液在2～15℃，12000～20000rpm离心15～40min，保留沉淀弃去上清液，沉淀为蛭弧菌游泳体，在沉淀中加入磷酸盐缓冲液调整蛭弧菌游泳体的浓度为10⁶～10⁹pfu/mL，得到蛭弧菌游泳体浓缩液，置于2～15℃保存备用；

（3）蛭弧菌制剂的制备：