[发明专利]一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用

权利要求书

1.一种蛭弧菌制剂的发酵方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）宿主菌悬液的制备：

将宿主菌培养至对数生长期，收集菌体，用磷酸盐缓冲液调整浓度，得到浓度为10¹⁷～10²²cfu/mL的宿主菌悬浮液，然后置于2～15℃中保存备用；所述宿主菌为粪肠球菌（Enterococcus faecalis）CGMCC1.131；

（2）蛭弧菌游泳体浓缩液的制备：

在磷酸盐缓冲液中加入步骤（1）制备的宿主菌悬浮液，调整宿主菌的浓度为10¹⁰～10¹⁵cfu/mL，再接入蛭弧菌斑，然后将此培养液在20～40℃培养20～60h，再在2～15℃，5000～8000rpm离心15～35min，保留上清液弃去沉淀，然后将上清液在2～15℃，12000～20000rpm离心15～40min，保留沉淀弃去上清液，沉淀为蛭弧菌游泳体，在沉淀中加入磷酸盐缓冲液调整蛭弧菌游泳体的浓度为10⁶～10⁹pfu/mL，得到蛭弧菌游泳体浓缩液，置于2～15℃保存备用；所述蛭弧菌为BDFM05，BDFM05于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209172；

（3）蛭弧菌制剂的制备：

将溶剂灭菌，得到发酵培养基；在发酵培养基中加入步骤（1）制备的宿主菌悬浮液和步骤（2）制备的蛭弧菌游泳体浓缩液，使宿主菌起始浓度为10¹⁰～10¹⁵cfu/mL，蛭弧菌游泳体起始浓度为10¹～10³pfu/mL，进行发酵；发酵温度控制在28～30℃，pH值控制在7.2～7.6；设置搅拌转速与溶氧联动，使溶氧水平控制在20%～30%；发酵过程中加1～3次宿主菌悬浮液，每次加入宿主菌悬浮液的间隔时间12～18h，每次加入宿主菌悬浮液的量以新加入的宿主菌在发酵培养基中的浓度为10¹⁰～10¹⁵cfu/mL为准；发酵培养36～48h即制成蛭弧菌制剂；所述溶剂为DNB液体培养基、蒸馏水或磷酸盐缓冲液。

2.根据权利要求1所述的一种蛭弧菌制剂的发酵方法，其特征在于：步骤（1）所述收集菌体的方式为通过离心分离得到，离心条件为2～15℃，5000～8000rpm离心15～35min；所述宿主菌悬浮液的浓度为10¹⁷～10²²cfu/mL；步骤（1）～（3）任一项所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1～0.3mol/L，pH为7.2～7.6；步骤（2）所述蛭弧菌游泳体浓缩液的浓度为10⁸～10¹²pfu/mL。

3.根据权利要求1所述的一种蛭弧菌制剂的发酵方法，其特征在于：步骤（3）所述灭菌的条件为121℃灭菌20min；所述蛭弧菌制剂的浓度为10⁸～10¹²pfu/mL；所述DNB液体培养基是将营养肉汤0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物0.1g溶于1000mL蒸馏水中，调节pH值至7.2～7.6。

4.一种蛭弧菌制剂，由权利要求1～3任一项所述方法制备得到。

5.根据权利要求4所述的蛭弧菌制剂在制备防治表皮葡萄球菌和大肠杆菌药物中的应用。