[发明专利]一种染色体特异位点的筛选方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种染色体特异位点的筛选方法，还涉及该筛选方法的应用，如产前检测。

背景技术

我国是人口大国，也是出生缺陷高发国家。根据卫生部最新发布的《中国出生缺陷防治报告（2012）》显示，出生缺陷日益成为我国突出的公共卫生问题和社会问题。目前我国每年出生新生儿约为1600万，出生缺陷发生率在5.6%左右，即每年新增出生缺陷约90万例。

造成大量先天缺陷的主要原因是染色体异常，其中染色体异常主要是指染色体的数目或者结构发生异常。数量异常指体细胞组织中正常二倍体46条染色体数目的改变，包括三体（一条额外的染色体）、单体（一条染色体缺失）和多倍体（整套额外的染色体）。结构异常指由染色体断裂及随后断裂的染色体末端在异常的位置愈合导致结构重拍，包括易位、倒位和插入等。染色体非整倍性是导致胎儿先天缺陷的重要原因之一，其引起最为常见的疾病包括唐氏综合征（T21）、爱德华氏综合征（T18）、帕陶氏综合征（T13）等，这三种染色体非整倍性异常占染色体非整倍体畸变95%以上，占全部染色体异常的80%～90%。

由于目前没有治疗染色体疾病的有效手段，降低生育染色体疾病患儿风险的最好方法就是通过产前遗传咨询及产前检测、诊断，尽早发现并解决问题。对于一些染色体遗传疾病的产前检测手段主要是血清学筛查（唐氏筛查）、颈项透明带（NT）检测、绒毛取样、羊水穿刺以及脐静脉血穿刺等，其中血清学筛查（唐氏筛查）和颈项透明带（NT）检测假阳性率比较高为5%，同时漏诊率也比较高为20%-40%。虽然绒毛取样、羊水穿刺以及脐静脉血穿刺准确率较高，但是具有一定的流产风险，同时能够进行穿刺的医生也比较少，资源比较紧缺。

新的检测方法在不断的研究之中。1997年，Lo等人（Lo Y.M.et al.1997.Lancet）在孕妇的外周血浆中发现了胎儿的游离DNA，使得科学家在理论上可以通过母亲血液检测胎儿DNA，从而检测胎儿的出生缺陷。然而血液中的游离胎儿DNA片段短，一般为166bp左右，而且含量较少，一般能够占总的游离DNA5%-30%，因而给全面的检测这些胎儿DNA带来了困难。近年来，随着高通量测序技术的发展，科学家可以通过测序技术来分析母体外周血中的胎儿游离DNA，这时候，无创DNA产前检测技术便从理论变成了现实。随后大量的临床试验验证了此技术，准确率高达99%以上，具有安全，无侵入性，准确率高，孕早期即可检测等特点。然而，此技术还有一定的不足，由于此技术需要对整个基因组DNA片段都进行检测，人类整个基因组的基因序列就有30多亿个碱基，对所有的这些碱基进行测序，需要测序量比较大，导致产前检测的价格比较高，不利于大规模的推广，如目前利用Illumina公司的Hiseq2000测序仪进行无创DNA产前检测，一个泳道最多能够完成12个样品，一个样品的检测价格5000多元。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种操作简单、成本低廉、测定准确的染色体特异位点的筛选方法。

本发明的第二目的是提供上述筛选方法在产前检测中的应用。

技术方案：本发明提供的一种染色体特异位点的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一，染色体特异位点的初步筛选：根据美国国立生物技术信息中心（NCBI）的人类基因组序列（GRCH Build37），对待研究的一条染色体特异位点初步筛选，得20-30万个初筛位点序列，所述初筛位点序列满足以下条件：

（1）序列长度的取值范围50-70bp；

（2）GC含量在45%～55%之间；

（3）序列中不包含字符“N”；

（4）与美国国立生物技术信息中心（NCBI）的单核苷酸多态性位点库（dbSNP）进行比较，序列中不存在任何单核苷酸多态性位点（SNP）；

（5）与美国国立生物技术信息中心（NCBI）的基因组变异数据库（DGV）中拷贝数变异（CNV）信息进行比较，位点不能包含在任何已知的拷贝数变异（CNV）中；

（6）位点之间在Tm值以及互补方面具有较大的兼容性；即两位点片段间不能有超过10bp的同源序列，片段间的Tm值相差在4度以内。

步骤二，染色体特异位点的比较去除：利用一些开源的工具（如：BWA、Bowtie等）将步骤一得到的初筛位点序列与人类基因组序列（GRCH Build37）比较分析，去除在多个地方匹配的位点，仅保留在一个位点匹配的序列，得5-10万个单一匹配位点序列；