[发明专利]同型半胱氨酸的检测方法及其诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种同型半胱氨酸的检测方法及其诊断试剂盒，尤其涉及一种利用DNA多聚酶活性的调控来检测样品中同型半胱氨酸含量的方法，以及依据该方法建立的诊断试剂盒。

背景技术

同型半胱氨酸（HCY）在人体内的浓度与心血管发病率有着密切的相关性。研究表明同型半胱氨酸与低密度脂蛋白反应经吞噬细胞吞噬后，该吞噬细胞会“破碎”并沉积于血管壁，通过一系列反应后将会有副产物氧化放出并损伤血管壁，然后平滑肌细胞分裂修补造成“疤痕”，同型半胱氨酸改变凝血因子水平，造成血小板聚集在血管壁的粥样硬化处等。临床上，在跟踪5年近1500个高同型半胱氨酸的男性中发现，排除其他因素后，其心脏病的几率将会增加3倍，血液中每增加5μmol/l同型半胱氨酸的浓度与胆固醇升高0.5mmol/l的效果是一样的，均对冠状动脉疾病发生具有相同的危险性，尤其是中年男性局部缺血性心脏疾病机会将增加1/3。此外还有许多研究表明高同型半胱氨酸血症与颈动脉粥样硬化相关，随着颈动脉硬化及狭窄的加重，血清中同型半胱氨酸的水平随之升高，且男性的水平高于女性，这可能与雌激素对同型半胱氨酸代谢的影响以及男性肌肉容量比女性大有关。

目前测定同型半胱氨酸的方法包括以下几种。一是由Refsum等人于1985年建立的同位素法，该方法通过¹⁴C标记的腺苷与HCY缩合后，经色谱分离，液体闪烁计数放射强度来检测HCY的浓度，其虽然灵敏度高，特异性强，但操作繁琐且有放射污染，未能推广使用。二是1987年Stabler等人首次报道的气相色谱-质谱法，该方法可同时测定半胱氨酸、蛋氨酸、胱硫醚和甲基甘氨酸等多种物质，虽然灵敏度、特异性好，但由于仪器价格昂贵而得不到广泛的推广。三是免疫学法，该方法应用特异性的抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆技术，采用荧光偏振法或免疫法测定HCY，其中美国雅培公司采用全自动荧光偏振免疫技术，用AXSYM仪器检测HCY，其反应原理为：正常人血浆中HCY约有1%并以还原型存在，70%与白蛋白结合，近30%形成小分子二硫化物，血浆标本在含二硫苏糖醇的预处理液作用下，HCY、混合的二硫化物及蛋白结合型等均被还原成游离HCY形式（即tHCY）：tHCY在S-腺苷-L-同型半胱氨酸（SAH）水解酶和过量腺苷存在的情况下，将被转换成SAH；预稀释的SAH混合物、抗SAH单克隆抗体及标记的荧光S-腺苷-L-半胱氨酸示踪物一同孵育，仪器自动检测偏振光的改变，即可测出标本中总HCY的水平。四是近年来国外研究出的新一代同型半胱氨酸测试法，即酶法，但该方法操作成本较高且有相应的专利保护。因此，快速，精确，简易的同型半胱氨酸测试方法有待于出现。

发明内容

为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种同型半胱氨酸的检测方法及其诊断试剂盒，该检测方法快速准确且操作简便，且建立在该检测方法上的诊断试剂盒使用起来精准可靠，简便易行，且操作成本低廉，有助于进行广泛推广。

本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种同型半胱氨酸的检测方法，包括以下步骤：

（1）选择同型半胱氨酸HCY的甲基转移酶产物S-腺苷-L-同型半胱氨酸SAH的特异性抗体，即抗SAH抗体；

（2）针对（1）中所选择的抗SAH抗体，制备能够与该抗SAH抗体特异性结合的SAH-DNA引物，并选择与该SAH-DNA引物中的DNA引物互补的DNA模板，建立DNA多聚酶反应体系；

（3）选择DNA多聚酶；

（4）将待测样品中未知量的HCY在过量S-腺苷-L-蛋氨酸的存在下由甲基转移酶转变成SAH，将该生成的SAH和已知并过量的（1）中所述抗SAH抗体结合；将该已知并过量抗SAH抗体中未与所述生成的SAH结合的部分与继续添加的已知量并过量（2）中所述SAH-DNA引物结合，所形成的结合物将抑制（3）中所述DNA多聚酶的活性并阻止新的双链DNA的形成；

（5）通过测定形成的新的双链DNA的含量来检测样品中HCY的含量。

其进一步的技术方案是：

制备SAH-DNA引物时通过在合适的DNA引物上引入能够与SAH交联的可交联基团。

所述可交联基团为羧基，该羧基能够被活化成活化酯基团，该活化酯基团能够和SAH中的氨基形成肽键。

所述SAH-DNA引物在同一时刻仅能与抗SAH抗体和DNA多聚酶中的一种相结合。