[发明专利]减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白及其制备方法和应用

说明书

本申请是中国发明专利申请的分案申请，原申请的申请日：2008年9月19日，申请号：200810013284.2，发明创造名称：减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白及其制备方法和应用，公开号：CN101560248A；在专利审查过程中，由于原申请中所涉及蛋白的氨基酸序列存在审查员指出的相似序列，申请人为得到更好的保护，现提出此分案申请。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体的说是一种减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

超抗原(superantigen，SAg)是一组由细菌或病毒编码的，并在极低浓度下对人体或其他哺乳动物T淋巴细胞产生极强免疫刺激活性的蛋白质分子。不像传统的抗原，超抗原不需要抗原递呈细胞的加工处理，在抗原递呈细胞外侧的抗原结合区与MHC II(组织相容性复合物)分子和T细胞Vβ区结合形成复合物，从而激发大量的T淋巴细胞增殖，进而导致在体外或体内释放产生大量的细胞因子和其它效应分子。正因为超级抗原存在这种特殊的生物活性和作用机理，所以致使其可以作为一种临床上的免疫调节剂和抗肿瘤药物，用于表达MHC II分子的肿瘤治疗。

金黄色葡萄球菌肠毒素C2(Staphylococcal enterotoxin C2，SEC2)是一类具有代表性的微生物外毒素。由于其极强的T细胞激活功能，成为一类典型微生物超抗原，近年来受到人们的广泛关注。但是，由于肠毒素C2超抗原的作用必须依赖于与免疫系统中的MHC II分子相结合，这必然会导致其在人体中可能与来自正常组织或细胞的MHC II分子的结合，从而对正常细胞也产生一定的毒性作用；此外，由于金黄色葡萄球菌肠毒素是一种细菌外毒素，因此在对人体会产生一定的毒素综合症(TSS)和食物中毒症状，并在临床上表现为呕吐、腹泻、以及致热等症状，因此限制了其临床应用和治疗可得效果。

因此，为减少肠毒素C2作为细菌外毒素所带来的边际效应和对人体的毒副作用，进而提高肠毒素C2在未来抗肿瘤方面的开发潜力，本发明通过基因定点突变技术对SEC2中与毒性相关的位点进行突变，从而达到减毒的目的。

发明内容

本发明目的在于提供一种减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白：所述减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白具有序列表SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15中碱基序列。

所述减毒肠毒素C2超抗原突变编码蛋白具有序列表SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16中氨基酸序列。

减毒肠毒素C2超抗原突变蛋白的制备方法：

以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’和sec2(C93A)-R:5’-GATGAAAAATATG CGTTTACATAG-3’;sec2(C93A)-F:5’-ATGTAAACGCATATTTTTCATCCAA-3’和sec2-R:5’-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTT GTTG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO:1中碱基序列sec2(C93A)突变基因；

以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物对sec2-F:5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’和sec2(D83A)-R:5’-TCCATACACAGCA ACTACTTCATCT-3’;sec2(D83A)-F:5’-GATGAAGTAGTTGCTGTGTATGGAT CAAAT-3’和sec2-R:5’-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’分别扩增获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点左侧和右侧的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO:3中碱基序列sec2(D83A)突变基因；