[发明专利]公斤级合成PNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种合成PNA的方法，具体涉及一种公斤级合成PNA的方法。

背景技术

寡核苷酸在治疗用药物、分子生物学研究工具及诊断试剂上应用广泛。寡核苷酸应用的主要制约在于它容易被核酸酶所降解、杂交后热稳定性差以及会与蛋白等非特异性结合等。为改造寡核苷酸的理化和生物学特性，许多寡核苷酸类似物被研究出来。肽核酸是寡核苷酸模拟物中的较为重要的一种。1991年Nielsen等报道了用N-(2-氨基乙基)甘氨酸骨架代替糖-磷酸酯骨架作为重复结构单元，合成了以肽键连接的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸(Peptide nucleic acid，PNA)。尽管PNA在结构上相对寡核苷酸有了显著的改变，但PNA与互补核酸之间的结合仍遵循碱基互补配对原则，甚至比天然核苷酸具有更高的亲和性，有较强的抗核酸酶和蛋白水解酶降解的能力。科研人员设计合成了各种结构的PNA，以优化其生物学稳定性和利用度、靶结合特性以及药代动力学特性，并将PNA应用于诊断和治疗等方面，从而开创了一个新的研究领域。

各种各样的构建模块被用于合成PNA及其类似物，包括骨架结构、在N-(2-氨基乙基)甘氨酸上连接手性和非手性的基团、碱基的类型等。经典的PNA的骨架单体是N-(2-氨基乙基)甘氨酸，在甘氨酸的氮上连接碱基的衍生物。通常先合成端基N有保护基的氨基乙基甘氨酸酯，然后再将碱基衍生物连在未受保护的氮上。常用的方法有：烷基化反应、席夫碱的还原反应、Mitsunobu反应。

四种碱基都是经胺的烷基化反应形成碱基乙酸衍生物，再采用通常的多肽合成的方法，联结碱基乙酸和骨架上的未受保护的氮。胸腺嘧啶的烷基化反应通常不需要使用保护基团，因此当与溴乙酸酯反应再经皂化或直接与溴乙酸反应即可得胸腺嘧啶乙酸。其余三种碱基上都有活泼基团，需先加以保护。胞嘧啶上的活泼基团为4位上的氨基，可选择的保护基有：苄氧羰基(benzyloxycarbonyl，Cbz)、对叔丁基苯甲酰基(4-tert-butylbenzoyl，4-t-BuBz)、苯甲酰基(benzoyl，Bz)以及Mmt等，再与溴乙酸酯进行烷基化反应，然后皂化即得胞嘧啶乙酸的衍生物。腺嘌呤的保护过程与胞嘧啶基本相同，可用的保护基有Cbz，Mmt，对甲氧基苯基(anisoly，An)。鸟嘌呤的保护比较复杂，需要在N9的烷基化的过程中避免N7烷基化的副反应干扰。一种常用的方法是在烷基化中用2-氨基-6-氯嘌呤，烷基化后再在酸性或碱性条件下回流，将氯水解转化为羰基，或是直接烷基化N2连有保护基的腺嘌呤，色谱分离N7/N9两种烷基化产物，然后皂化得鸟嘌呤乙酸的衍生物。

目前国内已经有部分公司可以定制合成PNA系列产品，但是他们的合成规模很小，一般在毫克级别，这种局面大大制约了PNA这种化合物的应用以及研究工作。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种公斤级合成PNA的方法，不通过柱层析的方法，大量生产高纯度的PNA。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

公斤级合成PNA的方法，包括以下步骤：

步骤1)1升三口瓶装入500毫升乙二胺，冰浴冷却至10度，将75克氯乙酸分批加入控制温度在10度以下，每批加完后，观察完全消耗掉之后再加下一批，加料完毕后，室温过夜反应，将乙二胺旋干，回收乙二胺可以循环使用，用油泵将乙二胺尽可能去除干净，用DMSO重结晶得到白色粉末状晶体，为N-(2-氨乙基)甘氨酸；

步骤2)将50克N-(2-氨乙基)甘氨酸溶于850毫升二氯甲烷和50毫升DMF的混合溶液中，加入134毫升(1.05mol)三甲基氯硅烷，反应混合物室温搅拌40分钟，然后冷却至5度，将134克Fmoc-OSu加入上面混合物中，在5度下滴加NMM186毫升，30分钟滴完，在此温度下搅拌2小时，然后加入100毫升甲醇，再搅拌20分钟，加入1升乙酸乙酯，20分钟后过滤固体，用乙酸乙酯洗涤，产品粉末旋干，产品水中打浆洗涤，过滤水洗，干燥得到纯品，为N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸；

步骤3)将12克N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸溶于100毫升的无水甲醇中，7.72毫升二氯亚砜在冰浴下滴入，滴完后此温度下继续反应15分钟，然后回流2小时，除掉溶剂，用9/1的乙醚和甲醇溶解，0度析晶，过滤，乙醚洗涤，干燥，得到纯品，为N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯盐酸盐；