[发明专利]基于Taqman探针的水产品中麦氏弧菌的荧光定量PCR快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于Taqman探针的水产品中麦氏弧菌（Vibrio metschnikovii）的荧光定量PCR快速检测方法。

背景技术

麦氏弧菌（Vibrio metschnikovii）是革兰氏阴性菌，短小稍弯曲的弧状菌，无芽孢、无荚膜，有偏端单鞭毛一根，运动方式呈直线穿梭样，嗜盐菌，TCBS（Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium）平板上生长，菌落呈黄色。麦氏弧菌是一种致病性弧菌, 广泛存在于河流、海湾和下水道中。麦氏弧菌被国内外学者公认为11种致病性弧菌之一，能够引起腹泻、创伤性感染和败血症。在饮用水中与腹泻病之间存在着密切的联系。

现有麦氏弧菌的检测方法主要有传统常规分离鉴定法、普通PCR检测法、ATB细菌鉴定法等。

基于Taqman探针的荧光定量PCR技术通过TaqMan探针与模板的特异性杂交来鉴别模板，具有很高的准确性，假阳性低，特异性好。目前尚未见用TaqMan探针快速检测水产品中麦氏弧菌的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测速度快、灵敏度高的快速检测水产品中麦氏弧菌的基于Taqman探针的荧光定量PCR方法。

研究表明：麦氏弧菌携带的rpoB基因是RNA聚合酶β亚单位编码基因，具有较高的保守性。本发明根据NCBI (美国国立生物技术信息中心)网站上公布的麦氏弧菌rpoB基因全序列，以该特异基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，并且采用荧光定量PCR快速技术检测麦氏弧菌，具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。可以作为水产品中麦氏弧菌的快速、简便、准确的检测方法。

本发明的技术解决方案是：一种快速检测麦氏弧菌的方法，其特征在于有如下步骤：

（1）首先提取待检样品TCBS平板上可疑菌落的基因组DNA。

（2) 荧光定量PCR反应液（25μL体系）：

其中包括提取的基因组DNA，2μL；10×PCR buffer，2.5μL；Mg²⁺，2mmol/L；Taq酶2U；UNG酶 1U；dNTP 0.2mmol/L；麦氏弧菌特异性引物 10pmol；TaqMan探针 5pmol，最后加灭菌去离子水至25μL。

（3) 荧光定量PCR仪程序参数：94℃ 预变性5min；94℃ 变性30s，58℃退火 30s，同时收集FAM荧光，72℃延伸 30s ，40个循环。

其中麦氏弧菌特异性引物为：

上游引物Vmetschnikovii -1：5'- GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC -3'

下游引物Vmetschnikovii -2：5'- CCAAGATGGTCGATATCATC -3'

特异性TaqMan探针为：

Vmetschnikovii-3：5'- CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3'

荧光定量PCR反应结束后，麦氏弧菌能形成典型的S型扩增曲线，而且Ct值<35。

方法建立后利用麦氏弧菌标准菌株和其他弧菌进行了特异性和敏感性实验。

1 荧光定量PCR特异性

利用建立的荧光定量PCR方法检测麦氏弧菌标准菌株ATCC 700040，结果显示麦氏弧菌用荧光定量PCR检测为阳性扩增，生成S形的荧光曲线，对溶藻弧菌ATCC 17749、最小弧菌CGMCC(B)1.1969、副溶血弧菌ATCC 17802、创伤弧菌CCGMC 1.1758、哈维氏弧菌CGMCC(B)1.1593和弗尼斯弧菌CGMCC(B)1.1613的检测结果均为阴性，结果见附图1。

2 荧光定量PCR敏感性

      麦氏弧菌标准菌株ATCC 700040在营养肉汤中36±1℃ 培养24小时后，10倍梯度稀释后，荧光定量PCR检测结果显示，25μL反应体系中，最低检测下线为102 CFU/25μL，此时荧光定量PCR扩增可以生成S形的荧光曲线，结果见附图2。

本发明提供了扩增麦氏弧菌的特异性引物Vmetschnikovii-1、Vmetschnikovii-2和TaqMan探针Vmetschnikovii-3，从而提供了一种快速检测麦氏弧菌的方法，同现有检测技术相比具有如下优势：

快速性：没有后处理，不用电泳、拍照，实时缩短了反应时间。