[发明专利]一种用于转基因水稻筛查的重组标准质粒及试剂盒

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种用于转基因水稻筛查的重组标准质粒，以及含有该重组标准质粒的试剂盒。 

（二）背景技术

自首例转基因番茄“FLAVR SAVR”于1994年在美国批准商业化生产以来，随着转基因技术迅速发展，许多有价值的外源基因导入了植物中，越来越多的转基因作物被批准在不同国家和地区商业化种植。对水稻而言，目前有许多抗虫、抗病、耐除草剂及营养成分改良的转基因水稻研发成功，转基因水稻品系：KF6、TT51和KMD1为我国拥有自主知识产权的抗虫Bt水稻，其中转基因抗虫水稻华恢1号（TT51）在2009年，我国农业部颁发了其在湖北省生产应用的安全证书。 

为保障在农产品进出口贸易中的利益,各国相继建立转基因标识制度,对转基因检测技术的准确度和灵敏度提出了严格的要求，目前对转基因作物及其产品的检测主要有蛋白质水平检测和核酸水平检测，而由于核酸的提取、保存及稳定性等方面的优势，使得基于核酸检测的转基因检测技术得到快速发展,其中以聚合酶链式反应(PCR)技术发展得最快，转基因作物PCR检测方法又分为4个层次，分别为筛查检测、基因检测、构建特异性检测和转化体特异性检测，在日常的检测工作中，由于转基因样品量较大，转基因的筛查工作显得尤为重要，而阳性标准品的缺乏无法满足转基因安全监管中筛查工作的需求，因此开发一种针对转基因水稻筛查检测用质粒标准分子具有重要的意义。 

阳性质粒分子的概念由日本科学家Kuribara H等于2002年提出，它是指一种含有转基因作物检测的目的外源基因和内标准基因的特异性扩增片段的线性化的重组质粒分子。阳性质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，且操作容易，同一个阳性质粒分子可以同时包含多个外源目的基因，质粒DNA提取容易且纯度较高。转基因作物阳性质粒分子是转基因标准物质的一种。开发阳性质粒分子可以有效的解决检测工作中缺乏有证标准物质和阳性材料的难题。 

（三）发明内容

本发明的目的是提供一种为转基因水稻筛查检测用重组标准质粒及其应用，满足转基因水稻安全监管筛查检测工作中的需求。 

本发明采用的技术方案是： 

一种用于转基因水稻筛查的重组标准质粒，由如下方法获得：利用重叠PCR技术将SEQ ID No.1所示的CaMV35S基因、SEQ ID No.2所示的SPS基因、SEQ ID No.3所示的Bt基因、SEQ ID No.4所示的NPTⅡ基因、SEQ ID No.5所示的Htp基因、SEQ ID No.6所示的Bar基因和SEQ IDNo.7所示的NOS基因依次连接获得融合片段，再利用分子克隆技术将所得融合片段克隆到载体pUC-19中，获得所述重组标准质粒，记为pUC-RS。 

CaMV35S基因序列如下（195bp）： 

Gctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatc 

SPS基因序列如下（290bp）： 

Atctgtttactcgtcaagtgtcatctcctgaagtggactggagctatggggagcctactgaaatgttaacctccgg ttccactgacggagagggaagcggtgagagtgctggtgcgtacattgtgcgcattccgtgcggtccaagggacaagtacttccgtaaagaggccctgtggccttacctccaagagtttgtcgacggagctctcgcgcatatcctgaacatgtccaaggctctgggggaacaggttagcaatgggaagctggtcttgccatatgtaatcctaggc 

Bt基因序列如下（301bp）：