[发明专利]一株BA5641基因缺失的炭疽杆菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株BA5641基因缺失的炭疽杆菌及其构建方法。

背景技术

炭疽杆菌（Bacillus anthracis）是一种杆状、能形成芽胞的革兰氏阳性杆菌，能够引起人畜的炭疽病，如果不及时治疗，死亡率极高。炭疽是五大人畜共患病之一，危害性极强，对世界各地的人类健康及畜牧业都构成了严重威胁。炭疽杆菌的芽孢接触到皮肤伤口、消化道或呼吸道上皮后，将感染并会导致皮肤炭疽、肺炭疽、肠道炭疽等疾病。肺炭疽最为严重，将很快导致疾病和死亡。炭疽杆菌还被用作生物战剂和制造生物恐怖，对社会稳定构成威胁。故炭疽杆菌相关研究一直广受关注。

炭疽杆菌疫苗的研发一直是各国关注的焦点。虽然在屠宰、解剖动物时，接触的主要是炭疽繁殖体，但炭疽感染多为芽孢被动摄入，通过皮肤、黏膜接触、呼吸道吸入和胃肠道摄入而感染。当芽孢进入机体接触血液、淋巴液后，可在20～40min内从休眠状态复苏，通过激活、发芽和长出3个连续阶段形成繁殖体而增殖。

减毒活芽孢苗采用无荚膜弱毒株，它是炭疽疫苗研制的重要途径。考虑到毒力恢复的潜在危险，只有俄罗斯和我国采用。我国采用杨叔雅等选育的A16R株，绵羊、兔、猴的保护结果显示其对炭疽强毒攻击保护率为75%～100%，人体接种安全，1961年投产使用至今。但因自然病例少，流行病学资料不够充分，接种采用皮上划痕，仍然存在接种剂量难以准确的不足。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组菌及其构建方法。本发明所提供的重组菌是BA5641基因缺失的炭疽杆菌。

本发明所提供的重组菌，是将炭疽杆菌基因组中的BA5641基因替换为含有抗性筛选标记物基因的DNA片段，得到的重组菌。

所述BA5641基因编码的蛋白为序列表中序列3所示的蛋白。

所述BA5641基因的编码区序列具体为序列表中序列2（GenBank：NC_003997的第5126232-5126669位）。

所述抗性筛选标记物基因可为壮观霉素抗性基因。

在本发明的一个实施例中，所述壮观霉素抗性基因的核苷酸序列具体为序列表中序列1的第1032-2161位。

在本发明的一个实施例中，所述含有抗性筛选标记物基因的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列1的第934-2257位。

在本发明中，所述炭疽杆菌具体为炭疽杆菌A16R株。

在基因水平上，更加具体的，本发明所提供的重组菌如下重组菌株：在所述炭疽杆菌A16R株的基因组序列中，将位于核苷酸序列为序列表中序列1的第1-933位所示的DNA片段（即上游同源臂，对应于GenBank号为NC_003997“Up date：2012-9-27”的序列的第5125293-5126225位）和核苷酸序列为序列表中序列1的第2258-3218位所示的DNA片段（即下游同源臂，对应于GenBank号为NC_003997“Up date：2012-9-27”的序列的第5126645-5127605位）之间的序列，替换为序列表中序列1的第934-2257位，得到的重组菌株。

本发明所提供的制备所述重组菌的方法，具体可包括如下步骤：

（a）将如下核苷酸片段克隆至温度敏感型穿梭质粒中，得到重组载体；

所述核苷酸片度自5’端至3’端依次为：在所述炭疽杆菌的基因组序列中位于所述BA5641基因上游的DNA片段1，所述抗性筛选标记物基因，以及在所述炭疽杆菌的基因组序列中位于所述BA5641基因下游的DNA片段2；

（b）将步骤（a）中得到的所述重组载体导入到所述炭疽杆菌，并在所述穿梭质粒的非敏感温度下进行培养，得到重组菌中间体；

（c）将步骤（b）中得到的重组菌中间体在所述穿梭质粒的敏感温度下进行培养，以去除所述重组载体，得到候选重组菌，从所述候选重组菌中获得所述重组菌。

在上述方法中，所述DNA片段1具体为序列表中序列1的第1-933位核苷酸所示的DNA片段，所述DNA片段2具体为序列表中序列1的第2258-3218位核苷酸所示的DNA片段；

更加具体的，所述核苷酸片段的序列为序列表中序列1。

所述温度敏感型穿梭质粒具体为pKSV7质粒；

步骤（b）中，所述的非敏感温度可为30℃；步骤（c）中，所述敏感温度可为37-40℃，在本发明的一个实施例中，具体为40℃。

所述方法中，在步骤（a）之前还包括将所述重组载体去甲基化的步骤。