[发明专利]一株BA5641基因缺失的炭疽杆菌及其构建方法

权利要求书

1.重组菌，是将炭疽杆菌基因组中的BA5641基因替换为含有抗性筛选标记物基因的DNA片段，得到的重组菌。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述BA5641基因的编码区序列为序列表中序列2。

3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述抗性筛选标记物基因为壮观霉素抗性基因；

所述壮观霉素抗性基因的核苷酸序列具体为序列表中序列1的第1032-2161位；或

所述含有抗性筛选标记物基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列1的第934-2257位。

4.根据权利要求1-3中任一所述的重组菌，其特征在于：所述炭疽杆菌为炭疽杆菌A16R株。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为如下重组菌株：在所述炭疽杆菌A16R株的基因组序列中，将位于核苷酸序列为序列表中序列1的第1-933位所示的DNA片段和核苷酸序列为序列表中序列1的第2258-3218位所示的DNA片段之间的序列，替换为序列表中序列1的第934-2257位，得到的重组菌株。

6.制备权利要求1-5中任一所述重组菌的方法，包括如下步骤：

（a）将如下核苷酸片段克隆至温度敏感型穿梭质粒中，得到重组载体；

所述核苷酸片段自5’端至3’端依次为：在权利要求1-5任一中所述炭疽杆菌的基因组序列中位于所述BA5641基因上游的DNA片段1，权利要求1-5任一中所述抗性筛选标记物基因，以及在权利要求1-5任一中所述炭疽杆菌的基因组序列中位于所述BA5641基因下游的DNA片段2；

（b）将步骤（a）中得到的所述重组载体导入到权利要求1-5任一中所述的炭疽杆菌，并在所述穿梭质粒的非敏感温度下进行培养，得到重组菌中间体；

（c）将步骤（b）中得到的重组菌中间体在所述穿梭质粒的敏感温度下进行培养，以去除所述重组载体，获得所述重组菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述DNA片段1为序列表中序列1的第1-933位核苷酸所示的DNA片段，所述DNA片段2为序列表中序列1的第2258-3218位核苷酸所示的DNA片段；或

所述核苷酸片段的序列为序列表中序列1；和/或

所述温度敏感型穿梭质粒为pKSV7质粒；和/或

所述非敏感温度为30℃，所述敏感温度为37℃-40℃。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述方法中，在步骤（a）之前还包括将所述重组载体去甲基化的步骤；

所述将所述重组载体去甲基化的方法，具体包括如下步骤：将所述重组载体导入甲基化酶缺陷的大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；从所述重组大肠杆菌中提取质粒，得到去甲基化的重组载体；

所述大肠杆菌具体为大肠杆菌SCS110。

9.如下（1）或（2）的生物材料：

（1）DNA分子，其核苷酸序列如序列表中序列1所示；

（2）含有步骤（1）中所述DNA分子的重组载体、表达盒、重组细胞系或重组菌；

所述重组载体具体为将所述DNA分子插入到温度敏感型穿梭质粒中得到的重组质粒；

所述温度敏感型穿梭质粒具体为pKSV7质粒。

10.权利要求1-5中任一所述重组菌在制备炭疽疫苗中的应用。