[发明专利]一种甘丙肽基因的单核苷酸多态位点及其应用

权利要求书

1.SEQ ID NO：1所示的部分甘丙肽基因的核苷酸序列中第53位核苷酸的A/G多态性序列在制备用于诊断女性抑郁症的试剂盒中的引物和/或探针的用途，所述多态性在NCBI SNP Database中的登记号为rs694066。

2.一种女性抑郁症易感性遗传筛查试剂盒，其特征在于所述试剂盒由包括：PCR扩增试剂和连接酶反应试剂；

其中所述的PCR扩增试剂是由分离包装的上下游引物、无MgCl₂的缓冲液、DNA聚合酶、MgCl₂、dNTP和水组成，所述的上下游引物的序列为：

上游引物：5′-TTTCGCGAGCTATCCAAAAG-3′(SEQ ID NO：2)

下游引物：5′-GTCCAGCCTCGTTTTTCCTT-3′(SEQ ID NO：3)

其中连接酶反应试剂是由分离包装的探针、连接缓冲液、连接酶和去离子水组成，其中探针序列为：

rs694066_modify：5′-

P-GGCATGGCAGAGGACTTAGAACAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3′；

rs694066_A：5′-

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAATGGGTGCACCCAGGCTTTCCT-3′；

rs694066_G：5′-

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAATGGGTGCACCCAGGCTTTCCC-3′。

3.根据权利要求2所述的女性抑郁症易感性遗传筛查试剂盒，其特征在于，所述的探针rs694066_modify，5′端磷酸化，3′端标记有5(6)-羧基荧光素(FAM)。

4.一种检测rs694066SNP位点的方法，具体步骤如下：

1)样品基因组DNA的提取：按照常规的DNA提取方法进行DNA提取；

2)目的基因片段的PCR扩增：扩增所用的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：3；目的基因PCR扩增条件：94℃预变性15min，94℃变性30s，62℃退火1min，72℃延伸1min，扩增35个循环，72℃延伸10min；

3)电泳检测扩增产物：利用普通1.5％琼脂糖电泳检测PCR产物的有无，扩增产物大小为152bp；

4)连接酶反应检测rs694066位点多态性：

4.1)对第3)步扩增出来的基因组片段进行连接酶检测反应检测rs694066位点多态性，配制连接反应体系：在PCR管中分别加入1μL连接缓冲液(10×)，0.5μL连接酶，6.5μL去离子水，1μL探针混合物，所述探针混合物包括：rs694066_modify、rs694066_A、rs694066_G，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6；充分混匀后离心，最后再加入1μL PCR反应产物；

4.2)连接酶反应在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems9600PCR仪上进行，设置程序为：95℃变性2min，35个循环，每个循环有2个温度，94℃30s，60℃2min。将PCR反应管放入PCR仪进行连接反应。

4.3)取1μL步骤4.2)所得的连接产物与1μL ABI GS-500ROX荧光标记分子量标准和1μL去离子甲酰胺上样液混合，95℃加热变性2分钟，冰中骤冷，于5％聚丙烯酰胺和5mol/L尿素中3000V电泳2.5小时，应用GENESCAN^TM672软件进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准；应用Genemapper软件进行数据分析和基因分型。

5)结果判定：当连接酶反应的产物有大小两种片段，那rs694066位点的基因型为AG；当只有一种产物的情况下，如产物片段较小时，rs694066位点的基因型为AA，如产物片段较大时，rs694066位点的基因型为GG。

5.根据权利要求4所述的探针混合物，其特征在于，所述的探针为rs694066_modify、rs694066_A和rs694066_G之间的摩尔比为2∶1∶1。