[发明专利]人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白、表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白、表达载体及其应用，具体涉及一种利用重组毕赤酵母生产的人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白及其表达载体，以及将该融合蛋白作为一种新型绿色饲料添加剂在动物饲料中的应用。

背景技术

畜禽养殖生产过程中，使用抗生素作为促生长剂用于预防动物疾病，提高饲料报酬的作法广为业内人士认同，已经延用了50多年。进入新世纪以来，随着对食品安全、卫生、药物残留等问题日益关注，抗生素的负面效应越来越引起人们的重视，加入WTO后，饲料质量和安全性的提高更是迫在眉睫。

溶菌酶具有杀菌效果强、杀菌谱广、稳定性强、易被机体所接受等优点，且还能促进免疫功能恢复，并且对人禽无毒、没有任何毒副作用和不良反应、无药害残留。作为一种生物制剂，溶菌酶本身无毒无害，因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂，在食品、医药、生物学中已得到了广泛的应用，同时也为饲料行业开发新型无公害绿色饲料添加剂开辟了一个新的途径。

溶菌酶又称细胞壁溶解酶，它广泛地存在于高等动物组织及分泌物、植物及各种微生物中，其中在新鲜的鸡蛋清中含量最高。作为一种糖苷水解酶，溶菌酶可选择性地分解微生物细胞壁的肽聚糖从而造成细胞溶解死亡。人溶菌酶（hLYS）由130个氨基酸残基组成，分子量为14.6kDa，具有很强的热稳定性（在pH=4-7、100℃情况下处理1min不失活），其溶菌活性比目前广泛使用的鸡蛋清溶菌酶高3倍。此外，与蛋清溶菌酶抑菌功能不同的是：该酶既对革兰氏阳性菌、好气性孢子形成的菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌具有良好的分解作用，也能在动物体内分泌型免疫球蛋白A、补体的参与下，水解相当部分的革兰氏阴性菌如大肠杆菌、普通变球菌和副血性弧菌等。

目前商品溶菌酶大多由蛋清中提取而来，价格较高，此外其仅对革兰氏阳性菌有作用，限制了其应用范围。近年来，在饲料行业中逐步开展了一些有关溶菌酶应用方面的研究工作，但还有待于进一步的研究开发。在我国，溶菌酶的应用范围和应用量还比较有限，但市场的需要量也在不断增长，可以预计溶菌酶将会是应用于我国饲料工业中一种重要的功能性添加剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白、表达载体及其应用，从而解决现有商品化蛋清溶菌酶在生产和应用方面的不足。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

所述的人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白，其碱基序列如SEQ ID No.3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

所述的人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白是由优化的人溶菌酶基因和谷胱甘肽转移酶基因构建而成。具体包括以下步骤：

1）人溶菌酶基因序列的优化

以高活性的人溶菌酶基因序列（GenBank：J03801.1）为出发模板，根据毕赤酵母密码子偏好性对该编码基因进行了重新设计（密码子优化、加GST标签等），并人工合成，从而使hLYS基因在重组毕赤酵母表达系统中更高效的转录、翻译、表达。经序列测定，人工合成的hLYS基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

2）构建人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白

分别针对上述优化后人工合成的人溶菌酶基因和谷胱甘肽转移酶基因（GenBank：U13853.1，258-977bp）设计上下游引物，并经PCR扩增，割胶回收琼脂糖电泳上1100bp左右的片段，经序列测定，该基因的碱基序列如SEQ ID No.3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，即为本发明的人溶菌酶-谷胱甘肽转移酶融合蛋白（以下简称融合蛋白）。

其中，PCR扩增过程中所设计引物如下：

P1：5’-GGCGA ATTCATG TCCCCTATACTAGGTTATTG-3’

P2：5’-GTCACGATGCGGCCGCTCGAGTCGAAAGGTTTTCGAAAGATGTGAATTGG-3’

P3：5’-GGCGCGGCCGCTTAAACACCACAACCTTGAACGTAT-3’