[发明专利]登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及核苷酸序列

说明书

技术领域

本发明属于检验检疫领域，涉及检测临床样品中登革热病原体登革病毒（Dengue Virus，DV）2型（DV-2），是一种登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及核苷酸序列。

背景技术

登革病毒（dengue virus，DV）是以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，引起登革热（dengue fever，DF）和登革出血热（dengue hemorrhagic fever，DHF）或登革休克综合征（dengue shock syndrome，DSS）的病原体。每年的登革病毒感染者超过1亿，登革病毒感染已成为全球严重的公共卫生问题。登革热主要流行于全球热带和亚热带地区。目前除欧洲以外所有大陆均有登革热的流行，尤其是东南亚、太平洋岛屿和加勒比海地区最为严重，我国主要是海南、广东、广西、台湾、福建等南方沿海地区。目前，全球登革热疫情不容乐观，必须加强对登革热在内的各种虫媒病毒病的控制和研究。随着人群对登革病毒一种血清型的自然免疫力的逐渐消退，以及登革病毒基因型多样性的增加和毒力增强变异株的出现，可能引起新的DF/DHF流行和暴发疫情，因此，做好登革热病例的早期检测、媒介监测等方面的研究至关重要。

登革病毒的自然宿主是人、某些低等灵长类动物和蚊。患者是主要传染源。一般在发病前一天至发病后第3～5日内传染性最强。在流行期间还有众多的轻型患者和隐性感染者，也是重要的传染源。人群对登革病毒普遍易感，感染后对同型病毒株有巩固的免疫力，并可维持多年，但对异型登革病毒仅有短暂的交叉免疫，故临床上有患两次以上登革热的可能。

DV是黄病毒属的单股正链RNA病毒，根据登革病毒E蛋白不同的抗原特性，利用血清中和试验将其分为1、2、3和4型四种血清型。当前世界范围内DV-2和DV-3是流行优势株，并可以发生复合感染。

DV的四个血清型（DV-1、DV-2、DV-3和DV-4），任何一种DV感染均可导致登革热（DF）、登革出血热（DHF）或登革体克综合征（DSS）。登革病毒在人体中，主要在单核-吞噬细胞内生长繁殖，在感染早期可出现特异性IgM抗体，4-5d后出现血凝抑制抗体，8-10d后出现中和抗体。IgG抗体可维持5-15年。人初次感染登革病毒后，可表现为隐性感染或一般的发热，症状不明显；机体可对同型病毒产生免疫力，而且可能持续终生，但对异型病毒感染的保护作用持续时间较短。初次感染登革病毒后二次感染异型登革病毒易发生登革出血热和登革休克综合征。

由于缺乏有效的同时针对四个血清型DV的疫苗，早期诊断成为降低DHF和DSS发病率和死亡率的关键。此外，DV感染的临床症状无特异性，很难与其他的急性发热疾病，如疟疾、黄热病、西尼罗热及地方性脑炎等热带病相区别。对确定有DHF/DSS症状的病人，及时有效的医疗护理成为减轻症状、避免死亡的唯一有效措施。因此，在疾病的早期，对不明原因的急性发热疾病和出血热进行鉴别诊断显得特别重要。

目前登革病毒诊断方法主要包括病毒分离、分子生物学检测和血清学检测。其中，病毒分离作为登革病毒诊断的金标准，不但可以检出病毒的存在，还能对病毒的型别进行鉴定，但该方法耗时，灵敏度低，而且需要特殊的仪器设备和专业技术人员。从Banditti早期报道的巢式RT-PCR检测到现在实时荧光PCR检测的应用，分子生物学检测技术最近十几年来有了较大的发展。目前，对DV感染的早期诊断、分型诊断以及区分其他相关黄热病毒的感染中，分子诊断技术在很大程度上代替了传统的病毒分离方法。

分子生物学检测技术的发展，为登革热的早期诊断提供了可能。应用普通RT-PCR方法可在1d内进行登革病毒的鉴定和分型诊断，但该方法易造成标本间的交叉污染而得到假阳性结果，因而在使用上受到一定限制。

实时荧光定量PCR技术是1996年首次由美国Applied Biosystems公司推出的，与传统的PCR技术相比，实时定量PCR检测方法实现了低拷贝数靶基因的定量分析，而且还具有特异性和敏感性更强、自动化程度更高以及污染可能性更小等优点。

作为一种新的核酸检测方法，实时荧光PCR技术已广泛应用于转基因检测、药物疗效评价、基因表达研究、传染病诊断等诸多领域，是目前国际公认的最灵敏、特异、重复性最好的核酸定性、定量检测方法。国内外已有多篇文章报道采用TaqMan实时荧光定量PCR技术检测登革病毒。随着技术的发展，实时荧光定量PCR正取代传统PCR，成为急性期患者血标本快速诊断登革病毒感染的新标准。